李博 曹坤 左石

膽道惡性腫瘤(以下簡稱膽道腫瘤)是一種起源于膽管上皮細(xì)胞，具有多層次異質(zhì)性、侵襲性的腫瘤，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈上升趨勢[1]。根據(jù)起源部位的不同，主要分為肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)、肝門部膽管癌(perihilar cholangiocarcinoma,PCC)、遠(yuǎn)端膽管癌(distal cholangiocarcinoma,DCC)及膽囊癌。由于臨床表現(xiàn)較晚，缺乏特異性體征和癥狀，膽道腫瘤患者通常在晚期確診，導(dǎo)致治療選擇有限且預(yù)后不盡人意，即使早期經(jīng)手術(shù)切除治療后，局部復(fù)發(fā)率也較高，總體5年生存率約30%[2]?；熆梢蕴岣咄砥谀懙滥[瘤患者的存活率，是目前不能手術(shù)切除患者的首選治療措施，一線化療是吉西他濱聯(lián)合鉑類藥物，但整體生存響應(yīng)率較低[3]。因此加入對(duì)膽道腫瘤生物學(xué)特征的研究在疾病早期篩查、早期診斷、早期治療等方面具有至關(guān)重要的臨床價(jià)值。隨著近年來基因組圖譜和生物信息學(xué)技術(shù)的顯著進(jìn)步，綜合基因組圖譜研究不僅發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)外膽管癌的基因組異質(zhì)性，還揭示了具有復(fù)雜相互作用的多個(gè)復(fù)發(fā)驅(qū)動(dòng)因素的改變，使人們對(duì)膽道腫瘤的生物學(xué)特性有了更深層次的認(rèn)識(shí)。本文將從遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、蛋白組學(xué)等相關(guān)方面對(duì)膽管癌生物學(xué)特性進(jìn)行綜述。

一、基因組及表觀基因組與膽道腫瘤

下一代測序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)針對(duì)全基因組的分析發(fā)現(xiàn)，膽道腫瘤具有不同病因的基因突變、基因擴(kuò)增、基因重排等生物信息。Jusakul等[4]對(duì)膽道腫瘤的全基因組和表觀基因組分析，揭示了膽道腫瘤的四個(gè)亞型，提出除解剖位置外,分子亞型可進(jìn)一步提供膽道腫瘤的臨床病理學(xué)特性及分子生物學(xué)信息，其中亞型1/2富含ERBB2擴(kuò)增和TP53突變，亞型3/4與BAP1和IDH1-2高突變相關(guān)，基于驅(qū)動(dòng)基因與病因及臨床病理特征之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)僅亞型1/2與肝吸蟲感染有關(guān)。值得注意的是，相關(guān)研究通過突變譜進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)這種基因突變分類(IDH1-2/BAP1/PBRM1與KRAS/TP53)在單變量和多變量分析中都是患者生存率的有力預(yù)測因子[5]。此前研究顯示，TP53突變的ICC患者HBsAg多為陽性，而KRAS突變僅在HBsAg陰性的ICC患者中檢測到[6]。最近兩項(xiàng)基于多組學(xué)數(shù)據(jù)研究評(píng)估了膽道腫瘤的相關(guān)驅(qū)動(dòng)因素，一項(xiàng)為Maeve A等的研究[7]，該研究通過NGS分析158例ICC病例發(fā)現(xiàn)最常見的改變基因是IDH1(30%)、ARID1A(23%)、BAP1(20%)、TP53(20%)和FGFR2基因融合(14%)；另一項(xiàng)為Robert等人的研究[8]，他們分析了150例PCC病例，發(fā)現(xiàn)KRAS(36.7%)、TP53(34.7%)、ARID1A(14.0%)和Smad4(10.7%)四種基因是最常見的基因突變。

二、表觀遺傳學(xué)與膽道腫瘤

腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞在表觀遺傳特征上的差異是顯著的，通常與腫瘤抑制基因表達(dá)的喪失和癌基因功能的獲得有關(guān)，表觀遺傳信息通過各種生化修飾進(jìn)行跨代傳遞，包括DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、染色質(zhì)重塑及非編碼RNA調(diào)控等。

1.DNA甲基化與膽道腫瘤:DNA甲基化是人類癌癥研究最廣泛的表觀遺傳學(xué)改變。在生物系統(tǒng)中，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化，與CpG甲基化結(jié)合蛋白相互作用，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，維持或改變DNA的結(jié)構(gòu)。哺乳動(dòng)物的DNA甲基化通常發(fā)生在CpG島，全基因組研究表明，近60%的CpG島位于人類基因的啟動(dòng)子中。DNA甲基化水平和模式的改變，如CpG島局部的高甲基化和基因組DNA低甲基化狀態(tài)與細(xì)胞周期、凋亡、增殖及腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展相關(guān)[9]。SOX17啟動(dòng)子在人膽管癌組織中高甲基化早有報(bào)道，另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)通過研究SOX17在膽管癌中的表達(dá)及其潛在的表觀遺傳調(diào)控，發(fā)現(xiàn)SOX17在膽管癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，并證實(shí)了SOX17啟動(dòng)子在膽道腫瘤組織中存在高甲基化，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與甲基化水平呈負(fù)相關(guān)[10]。既往的研究表明OPCML的高甲基化在膽道腫瘤組織中非常頻繁(72%)，而在癌旁組織中則不常見。最近，Wiphawan等[11]采用甲基化敏感高分辨熔融技術(shù)對(duì)膽道腫瘤患者血清游離DNA中OPCML、HOXA9基因甲基化進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)OPCML和HOXD9兩個(gè)甲基化基因聯(lián)合檢測的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為62.50%、100%、100%和72.72%。另一項(xiàng)研究中，通過對(duì)71例膽道腫瘤患者的腫瘤標(biāo)本和對(duì)照的癌旁組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)以SHOX2和SEPT9甲基化作為標(biāo)記物，區(qū)分膽道腫瘤和非膽道腫瘤的敏感性為45%，特異性為99%，并認(rèn)為SHOX2和SEPT9啟動(dòng)子甲基化可作為支持臨床標(biāo)本診斷、發(fā)現(xiàn)和治療的生物標(biāo)志物[12]。

2.組蛋白修飾和膽道腫瘤:染色質(zhì)組織的基本單位是核小體，它由一個(gè)組蛋白八聚體復(fù)合物組成，周圍環(huán)繞著DNA。通過特殊的表觀遺傳酶對(duì)組蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，促進(jìn)DNA修復(fù)和維持基因組的穩(wěn)定。組蛋白的各種修飾，如甲基化、乙?；⒘姿峄头核鼗?，都會(huì)改變二級(jí)DNA結(jié)構(gòu)，從而改變基因表達(dá)。核心組蛋白N端的乙?；艿浇M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白脫乙酰化酶(HDACs)的嚴(yán)格控制，HDACs去除組蛋白賴氨酸殘基上的乙酰基，導(dǎo)致染色質(zhì)凝聚，抑制轉(zhuǎn)錄。HDAC介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)改變在膽道腫瘤發(fā)病機(jī)制中的重要性已被報(bào)道[13]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HDACs2、HDACs3在膽道腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且HDAC2和/或HDAC3高表達(dá)的患者預(yù)后較差[14]。另一項(xiàng)研究報(bào)道，HDAC3在膽道腫瘤中的表達(dá)存在差異，且與臨床病理因素相關(guān)，高水平的HDAC3在誘導(dǎo)膽道腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)也抑制了癌細(xì)胞的凋亡[15]。大量研究表明，HDACs可通過多種途徑在致癌過程中發(fā)揮重要作用，HDACs抑制劑也可通過多種機(jī)制影響膽道腫瘤發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮抗癌作用，深入探討兩者之間的分子機(jī)制將可能為膽道腫瘤治療靶點(diǎn)預(yù)測提供新的思路[16]。

3.非編碼RNA與膽道腫瘤:高通量技術(shù)已經(jīng)使廣泛的基因組、外顯子組和轉(zhuǎn)錄組測序成為可能，也使得非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)的重要性得到證實(shí)，ncRNA在細(xì)胞分化、增殖、遷移、細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡等多種基本細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用。其中內(nèi)源性非編碼單鏈RNA(micro RNA,miRNA)是包括增值和凋亡在內(nèi)的各種生物過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在膽道腫瘤致癌狀態(tài)的啟動(dòng)、維持和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[17]。越來越多的證據(jù)表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在膽道腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,異常表達(dá)的lncRNA能與DNA、RNA、蛋白質(zhì)相互作用，可促進(jìn)膽道腫瘤的惡性表型并預(yù)測膽道腫瘤細(xì)胞的不良預(yù)后，lncRNA可能成為是膽道腫瘤最具潛力的生物標(biāo)志物或干預(yù)靶點(diǎn)[18]。相關(guān)研究通過檢測56例人膽道腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織中LncRNA AFAP1-AS1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)膽道腫瘤組織中AFAP1-AS1表達(dá)增加，且AFAP1-AS1高表達(dá)患者總生存期較短，并認(rèn)為AFAP1-AS1可作為膽道腫瘤一個(gè)新的潛在治療靶點(diǎn)[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA ZEB1-AS1具有較高的敏感性和特異性，可作為膽道腫瘤患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測因子，ZEB1-AS1可通過結(jié)合miR-133b增加癌基因同源盒B8(HOXB8)的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲[20]。大多數(shù)lncRNA除了充當(dāng)內(nèi)源競爭RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)的角色，可以調(diào)節(jié)相關(guān)的miRNA，也可直接作用于表觀調(diào)節(jié)因子從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此對(duì)膽道腫瘤中ncRNA的深入研究不僅能促進(jìn)對(duì)其分子和功能作用的理解，還有望發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物和新的治療策略。

三、蛋白組學(xué)與膽道腫瘤

蛋白組學(xué)指基因組表達(dá)的所有相應(yīng)蛋白，即細(xì)胞、組織或機(jī)體全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)形式，包括蛋白與蛋白相互作用、蛋白質(zhì)的表達(dá)水平及翻譯后的修飾等。蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)在發(fā)現(xiàn)膽道癌生物標(biāo)志物及治療靶標(biāo)中得到驗(yàn)證，細(xì)胞、組織、膽汁、血清等均可成為膽道癌生物學(xué)特征研究對(duì)象的重要來源[16]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常膽汁相比，膽管癌患者膽汁中共有63個(gè)蛋白質(zhì)顯著增加，其中，α-1抗胰蛋白酶陽性占70%[21]。另一項(xiàng)研究分析了膽道腫瘤和良性膽道疾病血清中的蛋白質(zhì)差異，結(jié)果顯示FAM19A5、MAGED4B、KIAA0321、RBAK和UPF3B在腫瘤和非腫瘤患者中表達(dá)存在顯著差異，可作為區(qū)分膽道腫瘤和良性膽道疾病的新的生物標(biāo)志物[22]。Le Faouder等通過非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)ICC中，參與細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)(ITGA4、ITGA7、Rho GTPase)、細(xì)胞生長(TRAF3IP3)、凋亡抑制(BCL2)和血管生成(PDGFRb、VCAM1、PECAM1)相關(guān)的蛋白高表達(dá)[23]。PPP3CA作為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的一個(gè)催化亞基，已被證明與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，Zengwei等[24]應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析膽道腫瘤與癌旁組織的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)233個(gè)差異蛋白表達(dá)，其中PPP3CA是膽道腫瘤預(yù)后不良的一個(gè)新的獨(dú)立因素。另一項(xiàng)研究采用同樣的方法，分析了2株膽道腫瘤細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)TPD52和DNAJB1在膽道腫瘤細(xì)胞系、組織和膽汁標(biāo)本中的表達(dá)水平升高，提示這些蛋白可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)TPD52和DNAJB1的表達(dá)水平與膽道腫瘤患者的臨床病例特征和預(yù)后密切相關(guān)[25]。

四、結(jié)語

膽道惡性腫瘤的發(fā)病分子機(jī)制十分復(fù)雜，診斷方面缺乏有效的生物標(biāo)志物，包括生物靶向治療在內(nèi)的現(xiàn)有治療方案難以取得令人滿意的治療效果。近年來，隨著多組學(xué)技術(shù)在高通量篩選的應(yīng)用使得膽道腫瘤在診斷、治療、預(yù)后等相關(guān)的生物標(biāo)記物研究得到廣泛認(rèn)識(shí)，也促進(jìn)了膽道腫瘤相關(guān)分子機(jī)制的研究。研究發(fā)現(xiàn)不同的解剖亞型和臨床亞型中存在不同的驅(qū)動(dòng)基因異常，眾多候選分子讓科研人員進(jìn)一步了解膽道腫瘤的生物學(xué)特性，但轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐仍需要很長一段時(shí)間，因此對(duì)腫瘤相關(guān)分子探索的同時(shí)，應(yīng)及時(shí)有效地從多組學(xué)方向分析已有的研究成果，尋找更具特異性及敏感性的分子或分子組合并驗(yàn)證它們在膽道腫瘤診斷、治療及預(yù)后中的潛在用途。此外，實(shí)現(xiàn)多領(lǐng)域、多學(xué)科的綜合性研究將會(huì)為尋找有效地早期生物標(biāo)志物提供廣闊的前景。