章天霞

（桐城市畜牧獸醫(yī)管理中心，安徽省安慶市 231400）

禽流感是禽流行性感冒的簡稱，又稱真性雞瘟或歐洲雞瘟，是由A型流感病毒引起的一種禽類傳染病。禽流感病毒（AIV）屬于RNA病毒的正黏病毒科，H5N1禽流感病毒為高致病性亞型，具有血凝素第5型、神經(jīng)氨酸酶第1型，可以感染人。其中，自2003年以來，H5N1導致了數(shù)百萬家禽感染，且其傳播迅速、病程短、死亡率高；H7N9是一種新型禽流感，2013年3月底在上海和安徽被發(fā)現(xiàn)，嚴重危害人類身體健康[1]。目前，這些高致病性禽流感給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，已被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部納入強制免疫監(jiān)測動物疫病范疇。同時，實踐表明，重組禽流感滅活苗具有使用安全、不會導致病毒擴散，可在常溫貯存和運輸、防疫期間無需攜帶冷藏設備，受母源抗體的影響少，產(chǎn)生抗體水平高，免疫效果與單價相似或更佳，減少接種次數(shù)及疫苗運輸、存放成本等優(yōu)勢。

在此背景下，為探究重組禽流感H5+H7亞型三價滅活苗（H5N1Re-11株、Re-12株+H7N9Re-2株）的免疫效果，減少禽流感的發(fā)生與傳播，筆者采用血凝和血凝抑制試驗，分別對2019年、2020年春防集中免疫雞血清樣品進行了禽流感病毒H5N1Re-11株、Re-12+H7N9Re-2株抗體水平的檢測，并對兩次試驗結果進行了綜合分析?，F(xiàn)將相關試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試試劑

供試試劑為肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司重組禽流感H5+H7亞型三價滅活苗（H5N1Re-11株、Re-12株+H7N9Re-2株）。

抗體檢測試劑為禽流感H5(Re-11)、H5(Re-12)血凝抑制試驗抗原（批號分別為20191012和20190828），禽流感H5(Re-11)、H5(Re-12)血凝抑制試驗陽性血清（批號分別為2 0 1 9 1 0 1 1和20190824），禽流感H7(Re-2)血凝抑制試驗抗原（批號為20190923），禽流感H7(Re-2)血凝抑制試驗陽性血清（批號為20190425），生產(chǎn)廠家均為哈爾濱國生生物科技股份有限公司。

1.2 免疫劑量及方法

2019年、2020年免疫雞在15～45日齡的，免疫劑量為0.3 mL/羽，頸部皮下注射；在45日齡以上的，免疫劑量為0.5 mL/羽，肌肉注射。

1.3 雞血清樣品來源

檢測雞血清樣品來自桐城市所轄的14個鄉(xiāng)鎮(zhèn)。于各鄉(xiāng)鎮(zhèn)（村）散養(yǎng)戶、規(guī)模養(yǎng)殖場分別隨機采集5～10份雞血清樣品[2]，2019年春防共計采集160份雞血清樣品，2020年春防共計采集215份雞血清樣品。

采樣時間均為集中免疫重組禽流感H5+H7亞型三價滅活苗后20～30 d。

1.4 檢測方法

根據(jù)《GB/T 18936-2003 高致病性禽流感診斷技術》規(guī)定的血凝與血凝抑制試驗方法進行操作[3]。

具體步驟：（1）采集3只SPF公雞（或體內(nèi)無禽流感和新城疫抗體的公雞）的血液，與等體積3.8%枸櫞酸鈉混合，離心后棄上清液，沉淀物中加生理鹽水洗滌3次，最后配成體積百分比為1%雞紅細胞懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩＃?）4單位抗原的配制。（3）血凝抑制（HI）試驗（微量法）。在微量反應板的第1～11孔加入生理鹽水25 μL，第12孔加入生理鹽水50 μL；吸取血清25 μL加入第1孔，充分混勻后吸25μL于第2孔依次倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25 μL棄去；第1～11孔均加入含4 HAU混勻的病毒抗原液25μL，微量振蕩30 s，室溫（約20 ℃）靜置至少30 min；每孔加入25 μL體積百分比為1%的雞紅細胞懸液混勻，微量振蕩30 s，靜置30 min（室溫約20 ℃，若環(huán)境溫度太高則置于4 ℃條件下進行）。（4）結果判定。對照紅細胞將呈現(xiàn)點狀沉于孔底，傾斜70°后，以流淌呈線狀的孔數(shù)為血凝抑制效價，記作2n；以完全抑制4單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI的滴度；待檢血清HI效價≥4 log2時，判定為抗體合格。

2 結果與分析

由表1可知，2019年春防集中檢測雞血清樣品共160份，其中，H5免疫抗體合格率為86.25%，H7免疫抗體合格率為83.75%，H5+H7同為陽性的占76.25%。

表1 2019年集中檢測H5、H7免疫抗體情況 (單位：份)

由表2可知，2020年春防集中檢測雞血清樣品共215份，其中H5免疫抗體合格率為87.91%，H7免疫抗體合格率為87.44%，H5+H7同為陽性的占85.58%。

綜上，經(jīng)重組禽流感三價滅活苗接種后，家禽體內(nèi)產(chǎn)生H5免疫抗體的平均合格率為87.08%，產(chǎn)生H7免疫抗體的平均合格率為85.60%，均達到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對高致病性禽流感防疫的總體要求（存欄家禽的有效免疫抗體合格率達7 0%以上）。同時，H5+H7同為陽性的平均符合率為80.92%，表明經(jīng)重組禽流感三價滅活苗接種后，大部分家禽機體內(nèi)能同時產(chǎn)生H5、H7免疫抗體，且基本無相互拮抗現(xiàn)象。

表2 2020年集中檢測H5、H7免疫抗體情況 (單位：份)

3 結論與討論

試驗結果表明，重組禽流感H5+H7亞型三價滅活苗（H5N1Re-11株、Re-12株+H7N9Re-2株）的免疫效果良好，大多數(shù)家禽能產(chǎn)生較強的保護抗體[4]，可以推廣應用。

同時，經(jīng)分析，免疫失敗的原因可能為：（1）免疫程序不合理；（2）家禽自身存在某些免疫抑制性疾病或其他能導致免疫力下降的疾病；（3）家禽的品種差異，有的個體甚至有先天缺陷；（4）接種疫苗時存在應激反應；（5）免疫次數(shù)和采樣時間不同；（6）疫苗注射劑量不夠或過高；（7）疫苗稀釋錯誤、稀釋后未及時使用；（8）接種前后使用了免疫抑制性藥物等。