周俊華 黃光云 黃麗霞 羅鮮青 何仁春 周志揚 梁琪妹 黃香 廖玉英 王啟芝

摘要：【目的】研究微生物添加劑對甘蔗尾葉青貯細菌多樣性的影響，為甘蔗尾葉青貯技術優(yōu)化提供參考依據(jù)?！痉椒ā吭囼炘O3個處理：處理1在新鮮甘蔗尾葉中添加1%植物乳桿菌和3%米曲霉，處理2添加1%飼用復合微生物制劑，以新鮮甘蔗尾葉直接青貯為對照處理。青貯原料切碎后與添加劑充分混勻，密封，室溫青貯45 d后采樣，放入無菌樣品袋，-80 ℃保存。采用Miseq高通量測序分析甘蔗尾葉青貯細菌門、屬水平群落結構，并對3個處理的甘蔗尾葉青貯進行感官評定?！窘Y果】對照、處理1和處理2甘蔗尾葉青貯的感官評定等級分別為良好、良好和一般。3個處理甘蔗尾葉青貯細菌共有操作分類單元（OTU）182個，對照、處理1和處理2特有OTUs分別為179、319和3321個，OTUs總數(shù)分別為845、1115和3815個。處理2的甘蔗青貯細菌群落Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均顯著高于對照和處理1（P<0.05，下同），處理1的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著高于對照，3個處理的覆蓋指數(shù)均接近1.00。在門水平上，對照和處理1甘蔗尾葉青貯的優(yōu)勢細菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），相對豐度分別為95.92%、2.46%和84.90%、13.79%;處理2的優(yōu)勢細菌門為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門（Bacteroidetes），相對豐度分別為74.67%、23.52%和1.61%。在屬水平上，對照甘蔗尾葉青貯細菌中相對豐度在1.00%以上的屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）、梭菌屬IV群（Clostridium_IV）和嚴格梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto），三者相對豐度分別為84.28%、1.18%和5.14%;處理1中，乳桿菌屬、醋酸桿菌屬（Acetobacter）和芽孢桿菌屬（Bacillus）3個屬的相對豐度在1.00%以上，分別為78.56%、12.78%和4.14%;處理2甘蔗尾葉青貯細菌中相對豐度在1.00%以上的屬有10個，其中腐敗菌腸桿菌科未分類菌屬（Enterobacteriaceae_unclassified）（47.64%）、梭菌科未分類菌屬（Clostridiaceae_1_unclassified）（7.62%）、梭菌屬IV群（Clostridium_IV）（4.79%）和腸桿菌屬（Enterobacter）（7.38%）占絕對優(yōu)勢，乳桿菌屬相對豐度僅為0.81%?！窘Y論】甘蔗尾葉添加飼用復合微生物制劑進行青貯，其物種數(shù)最豐富，但腐敗菌未得到抑制;甘蔗尾葉添加植物乳桿菌和米曲霉進行青貯可顯著提高甘蔗尾葉青貯細菌群落的繁殖生長，進而提高甘蔗尾葉青貯的微生物多樣性及群落相對豐度，可在甘蔗尾葉青貯中應用。

關鍵詞： 甘蔗尾葉;微生物添加劑;青貯;細菌多樣性

中圖分類號： S816.53? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）09-2254-07

Effects of microbial additives on bacterial diversity of

sugarcane tops silages

ZHOU Jun-hua1， HUANG Guang-yun1， HUANG Li-xia1， LUO Xian-qing1， HE Ren-chun1， ZHOU Zhi-yang1， LIANG Qi-mei1， HUANG Xiang1， LIAO Yu-ying2*， WANG Qi-zhi1*

（1Animal Husbandry Research Institute of Guangxi， Nanning? 530001， China; 2Guangxi Veterinary Research Institute，Nanning? 530000， China）

Abstract：【Objective】The objective of the present study was to investigate the effects of microbial additives on bacterial diversity of sugarcane tops silages，and provide reference for sugarcane tops silage. 【Method】Three treatments were set： treatment 1 adding 1% Lactobacillus plantarum and 3% Aspergillus oryzae in fresh sugarcane tops， treatment 2 adding 1% the compound microbiological preparation in fresh sugarcane tops， controlwithout any microbal additive in the fresh sugarcane tops. Fresh sugarcane tops were cut， mixed with additives， sealed， and sampled after 45 d of ensiling， and put into sterile sample bag and stored at -80 ℃. Miseq high-throughput sequencing technology was utilized to detect the bacterial composition of sugarcane tops silages at the phylum level and the genus level. Sensory evaluation was used to assess the quality of sugarcane tops silage in three treatments. 【Result】The sensory evaluation grades of control，treatment 1 and treatment 2 were fine，fine and general，respectively. The results showed that， at the operational taxonomic units（OTUs） level，182 OTUs were shared by all samples in the three treatments，there were 179 special OTUs in control group，319 special OTUs in treatment 1 and 3321 special OTUs in treatment 2， and total OTUs in control， treatment 1 and treatment 2 were 845，1115 and 3815， respectively. Shannon index，Chao1 index of treatment 2 were significantly higher than those in the control group and treatment 1（P<0.05， the same below）. Shannon index， Simpson index of treatment 1 were significantly higher than those in the control group. The coverage index of the three treatments all near 1.00. At the phylum level，the dominant bacteria of control group were Firmicutes and Proteobacteria，with relative abundance of 95.92% and 2.46%; the dominant bacteria? of treatment 1 were Firmicutes and Proteobacteria，with relative abundance of 84.90% and 13.79%; the dominant bacteria of treatment 2 were Proteobacteria， Firmicutes and Bacteroidetes，with relative abundance of 74.67%，23.52% and 1.61%. At the genus level， the bacteria whose relative abundance was over 1.00% of control group were Lactobacillus， Clostridium_IV and? Clostridium_sensu_stricto ，with relative abundance of 84.28%， 1.18% and 5.14%; the bacteria whose relative abundance was over 1.00% of treatment 1 were Lactobacillus， Acetobacter and Bacillus， with relative abundance of 78.56%，12.78% and 4.14%. There were ten bacteria whose relative abundance was over 1.00% in treatment 2，but the Enterobacteriaceae_unclassifie（47.64%），Clostridiaceae_1_unclassified（7.62%）， Clostridium_IV（4.79%） and Enterobacter（7.38%） were dominant in the ten bacteria，relative abundance of Lactobacillus was only 0.81%. 【Conclusion】Adding the compound microbiological preparation in fresh sugarcane tops treatment has the most abundant species but the spoilage bacteria are not inhibited. Adding L. plantarum and A. oryzae in fresh sugarcane tops can significantly improve the growth and reproduction of bacterial community， and improve the microbial diversity and community abundance of the sugarcane tops silages， which can be a reference for the actual production of sugarcane tops silage.

Key words： sugarcane tops; microbial additives; silage; bacteria diversity

Foundation item： Guangxi Science and Technology Plan Project（Guike AB16380175）;Nanning Scientific Research and Technology Development Project（20182195）; Guangxi Public Welfare Research Institute Project（GMYZX 2019-11）

0 引言

【研究意義】甘蔗是廣西重要的特色農作物之一，年種植面積在100萬ha以上。甘蔗尾葉是甘蔗頂部2～3個嫩節(jié)及附帶的整個葉片，約占整株甘蔗全重的20%。每年11月—翌年4月是甘蔗收獲期，也是青綠飼料生產的淡季;而大量的甘蔗尾葉被當作廢棄物焚燒，不僅造成資源浪費，還污染環(huán)境。若能有效利用甘蔗尾葉，既可緩解冬季反芻動物養(yǎng)殖業(yè)青綠飼料短缺的問題，又能促進廢棄物資源化利用及農作物秸稈的綜合利用。甘蔗尾葉粗纖維含量高，質地粗硬，通過青貯發(fā)酵可改善其適口性，提高其營養(yǎng)品質，同時延長儲存時間。青貯是一個由多種微生物參與的復雜發(fā)酵過程，不同微生物對青貯品質有不同影響。因此，全面了解經不同微生物添加劑處理的甘蔗尾葉青貯微生物群落結構及有害菌種類，對微生物添加劑的安全使用及青貯調控均具有重要意義。【前人研究進展】青貯過程是多種微生物參與的復雜發(fā)酵體系，不同微生物對青貯飼料品質的影響有所不同。穆勝龍等（2018）、唐振華等（2018）研究表明，新鮮甘蔗尾葉添加植物乳桿菌和布氏乳桿菌進行青貯，可改善甘蔗尾葉青貯品質，并提高甘蔗尾葉青貯的有氧穩(wěn)定性。周俊華等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，添加乳酸芽胞桿菌和黑曲霉進行甘蔗尾葉青貯，可改善甘蔗尾葉營養(yǎng)價值。高通量測序是可最大限度保留菌群原有群落組成及分布特征的一種免培養(yǎng)分子生物學技術。Li等（2015）采用高通量測序技術檢測到巴茅青貯過程中30多個菌屬群落的變化情況。陶蓮和刁其玉（2016）采用高通量測序技術檢測分析了玉米秸稈青貯前后整個群落結構及微生物豐度的變化信息。胡宗福等（2017）研究表明，全株玉米青貯在發(fā)酵前期、后期和開袋期3個階段，微生物群落組成有明顯變化。劉蓓一等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，大麥青貯第2～60 d的優(yōu)勢菌群是乳桿菌屬，而有氧暴露后，有害菌沙雷氏菌屬和不動桿菌屬等的相對豐度有所增加。【本研究切入點】目前，尚無采用高通量測序技術對添加微生物制劑的甘蔗尾葉青貯細菌多樣性進行檢測分析的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】采用MiSeq高通量測序技術，檢測分析直接青貯、植物乳桿菌及米曲霉、飼用復合微生物制劑對甘蔗尾葉青貯細菌門、屬水平群落結構的影響，為甘蔗尾葉青貯技術優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

新鮮甘蔗尾葉來源于廣西崇左市扶綏縣甘蔗種植區(qū)，揉搓切碎至2 cm左右。植物乳桿菌和米曲霉由廣西畜牧研究所動物營養(yǎng)實驗室保存提供，飼用復合微生物制劑（枯草芽孢桿菌≥5.6×107 CFU/g，沼澤紅假單胞菌≥2.0×107 CFU/g，乳酸菌≥4.0×106 CFU/g）購自南寧微瑞生物科技有限公司。

1. 2 試驗設計

試驗設3個處理，每處理3個重復。處理1：新鮮甘蔗尾葉添加1%植物乳桿菌菌液（7.6×106 CFU/mL，采用平板計數(shù)法檢測菌液濃度）和3%米曲霉（1.3×108 CFU/g，采用血球計數(shù)法進行孢子計數(shù)）;處理2：新鮮甘蔗尾葉添加1%飼用復合微生物制劑;處理3：對照，不添加微生物制劑。青貯原料與添加劑充分混勻，裝入青貯袋壓實并用真空壓包機封口，每袋裝樣品8 kg，室溫青貯45 d后，用無菌鑷子采樣，放入無菌樣品袋，-80 ℃保存待測。

1. 3 甘蔗尾葉青貯細菌高通量測序

1. 3. 1 甘蔗尾葉青貯細菌基因組DNA提取 利用E.Z.N.A? Stool DNA Kit試劑盒（上海哈研生物科技有限公司）提取甘蔗尾葉青貯細菌基因組DNA，通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，采用紫外分光光度計對所提取DNA進行定量分析。

1. 3. 2 甘蔗尾葉青貯微生物群落結構MiSeq高通量測序 以16S rDNA為目標區(qū)域進行引物設計，引物序列為341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'），805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。PCR反應體系25.0 μL：Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix（New England Biolabs）12.5 μL，正、反向引物各2.4 μL，50 ng DNA模板，ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序：98 ℃預變性30 s;98 ℃ 10 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進行25個循環(huán);72 ℃延伸10 s。擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并采用AMPure XT beads Kit對目標片段進行回收純化。參照MiSeq Reagent Kit V3（深圳海恩安生物技術有限公司）說明，使用MiSeq測序儀進行2×300 bp的雙端測序。

1. 3. 3 生物信息分析 采用FLASH（v1.2.8）軟件，依據(jù)雙端序列的Overlap關系，將序列拼接成Tag，并去除Barcode及引物序列，采用Vsearch（v2.3.4）過濾嵌合體。經預處理的Cleandate經Vsearch分析后獲得的有效序列作為該操作分類單元（OTU）的代表序列。使用QIIME（v1.8.0）分析α多樣性。使用BLAST進行序列比對，將OTU代表序列與RDP（核糖體數(shù)據(jù)庫）及NCBI-16S數(shù)據(jù)庫對每個代表序列進行物種注釋。圖片均采用R包（v3.2.5）實現(xiàn)。利用Excel 2007對甘蔗尾葉青貯細菌門、屬水平的相對豐度進行統(tǒng)計，采用SPSS 17.0對α多樣性指數(shù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA），研究分析微生物菌劑對甘蔗尾葉青貯細菌門、屬水平相對豐度的影響。

1. 4 甘蔗尾葉青貯感官評定

依照《青貯飼料質量評定標準》（劉建新，1996）對3個處理的甘蔗尾葉青貯進行感官評定，評判標準參考表1。

2 結果與分析

2. 1 甘蔗尾葉青貯的感官評定結果

依照《青貯飼料質量評定標準》對3個處理甘蔗尾葉的pH、水分、色澤、氣味和質地等進行感官評定，評定結果見表2。甘蔗尾葉經45 d青貯后，對照、處理1和處理2的感官評定等級分別為良好、良好和一般，其中處理1的甘蔗尾葉青貯pH為3.92、水分含量77%、色澤亮黃、松散軟柔不黏手、氣味無不舒適感，總分最高，為69分。

2. 2 甘蔗尾葉青貯細菌OTUs基礎分析結果

OTU是人為給定品系、種和屬等某一分類單元設置的同一標志。對來自于同一環(huán)境的所有樣品序列進行合并，并將相似性大于97%的序列歸類為一個OTU。由圖1可知，3個處理甘蔗尾葉青貯細菌共有OTUs為182個，對照特有OTUs為179個，處理1特有OTUs為319個，處理2特有OTUs為3321個。對照、處理1和處理2的甘蔗尾葉青貯細菌OUTs分別為845、1115和3815個。

2. 3 微生物添加劑對甘蔗尾葉青貯細菌群落α多樣性的影響

Shannon指數(shù)主要用于描述OTUs出現(xiàn)的紊亂及不確定性，不確定性越高，多樣性指數(shù)越高。由表3可知，3個處理甘蔗尾葉青貯細菌群落的Shannon指數(shù)差異顯著（P<0.05，下同），變化范圍為2.20～7.72，其中處理2的Shannon指數(shù)最高，顯著高于處理1和對照。Simpson指數(shù)越高，表示樣品物種多樣性越豐富。由表3可知，3個處理甘蔗尾葉青貯細菌群落的Simpson指數(shù)變化范圍在0.44～0.98，處理2和處理1顯著高于對照，但處理2與處理1間無顯著差異（P>0.05，下同）。Chao1指數(shù)在生態(tài)學中主要用來估測物種豐富度，數(shù)值越高代表物種越多。由表3可知，處理2甘蔗尾葉青貯細菌群落的Chao1指數(shù)顯著高于對照和處理1，對照與處理1間差異不顯著，但處理1較對照有所增加。覆蓋指數(shù)用于表示本次測序相對于整體樣本的覆蓋程度，數(shù)值越高，覆蓋程度越高。由表3可知，3個處理甘蔗尾葉青貯細菌群落的覆蓋指數(shù)均接近1.00，表明樣品中微生物群落基本被檢測出。

2. 4 微生物添加劑對甘蔗尾葉青貯細菌門水平群落組成及其相對豐度的影響

由圖2可知，對照甘蔗尾葉青貯的優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其相對豐度分別為95.92%和2.46%，兩者總相對豐度達98.38%。處理1甘蔗尾葉青貯的優(yōu)勢細菌門也是厚壁菌門和變形菌門，相對豐度分別為84.90%和13.79%，兩者總相對豐度達98.69%。處理2甘蔗尾葉青貯的優(yōu)勢細菌門為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門（Bacteroidetes），相對豐度分別為74.67%、23.52%和1.61%，3個菌門的總相對豐度達99.80%。

2. 5 微生物添加劑對甘蔗尾葉青貯細菌屬水平群落組成及其相對豐度的影響

由圖3可知，在處理1甘蔗尾葉青貯細菌群落中，乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋桿菌屬（Acetobacter）和芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對豐度均在1.00%以上，分別為78.56%、12.78%和4.14%，三者總相對豐度為95.48%。在處理2甘蔗尾葉青貯細菌群落中，相對豐度在1.00%以上的菌屬有10個，總相對豐度為90.90%，其中腸桿菌科未分類菌屬（Enterobacteriaceae_unclassified）占優(yōu)勢地位，相對豐度達47.64%，隨后依次為蘭奧爾菌屬（Raoultella）（8.38%）、梭菌科未分類菌屬（Clostridiaceae_1_unclassified）（7.62%）、腸桿菌屬（Enterobacter）（7.38%）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）（5.75%）、梭菌屬IV群（Clostridium_IV）（4.79%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）（3.53%）、瘤胃菌科未分類屬（Ruminococcaceae_unclassified）（2.83%）、梭菌屬（Clostridium）（1.88%）和沙雷氏菌屬（Serratia）（1.10%），其他各菌屬的相對豐度不高，但也占有一定比例。在對照甘蔗尾葉青貯細菌群落中，相對豐度在1.00%以上的屬有乳桿菌屬、梭菌屬IV群和嚴格梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto），三者總相對豐度達90.60%，其中乳桿菌屬（84.28%）占絕對優(yōu)勢地位。

3 討論

青貯是青貯原料附著微生物、發(fā)酵微生物和腐敗變質微生物參與的復雜過程（Muck，2013），因此，對青貯飼料微生物的群落組成進行研究具有重要意義。Eikmeyer等（2013）研究報道，在飼草青貯過程中，青貯第14 d和第58 d厚壁菌門的相對豐度分別為86.00%和87.00%。McGarvey等（2013）研究報道，苜蓿青貯主要的優(yōu)勢菌門是厚壁菌門和變形菌門。劉蓓一等（2019）研究報道，在大麥青貯期，厚壁菌門是絕對優(yōu)勢菌門。產芽孢菌群、支原體菌群及非產芽孢菌群均屬于厚壁菌門，且大部分厚壁菌門可降解淀粉、纖維素和蛋白質等大分子化合物（Romero et al.，2017）。大腸桿菌、弧菌、螺桿菌及歐文氏菌屬、甲基桿菌屬和假單胞菌屬等均屬于變形菌門，是細菌中最大的菌門（Peng et al.，2018）。變形菌門內的物種在農業(yè)、環(huán)保及工業(yè)等領域具有重要價值，已廣泛用于污染物降解及廢水處理等。本研究通過MiSeq高通量測序技術對甘蔗尾葉青貯細菌群落組成進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，變形菌門和厚壁菌門是3個處理甘蔗尾葉青貯的優(yōu)勢細菌門，與Eikmeyer等（2013）、McGarvey等（2013）、劉蓓一等（2019）的研究結果基本一致?？梢?，變形菌門和厚壁菌門在青貯中發(fā)揮重要作用。在后續(xù)甘蔗尾葉青貯研究中，分離培養(yǎng)變形菌門和厚壁菌門細菌并用于甘蔗尾葉青貯，對于改善甘蔗尾葉青貯品質將具有指導意義。

濕度、溫度、青貯原料及區(qū)域氣候環(huán)境等均會影響青貯飼料中優(yōu)勢群落的種類（熊乙等，2017）。Dunière等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，類芽孢桿菌、黃桿菌、鞘氨醇單胞菌及微小桿菌等是玉米青貯的優(yōu)勢細菌。陶蓮和刁其玉（2016）研究發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈青貯45 d后，片球菌屬（22.65%）、魏斯氏菌屬（9.98%）及乳桿菌屬（9.74%）為優(yōu)勢菌群。豆艷麗等（2019）研究報道，全株玉米青貯過程中乳酸桿菌屬和魏斯氏屬是優(yōu)勢細菌屬。本研究中，在屬水平上，對照的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬、梭菌屬IV群和嚴格梭菌屬;處理1的優(yōu)勢細菌屬為乳桿菌屬、醋酸桿菌屬和芽孢桿菌屬;處理2的乳酸菌屬相對豐度低于1.00%，非乳酸菌屬主要有腸桿菌科未分類菌屬、梭菌科未分類菌屬、蘭奧爾菌屬、 腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、梭菌屬IV群、瘤胃球菌屬和瘤胃菌科未分類屬。對照和處理1的絕對優(yōu)勢菌屬均為乳桿菌屬，而處理2的優(yōu)勢菌屬為非乳酸菌屬。乳酸菌是制作優(yōu)良青貯飼料的主要微生物，具有抑制腐敗菌及其他有害菌繁殖的作用，進而防腐保鮮青貯飼料。腸桿菌可對青貯飼料中的蛋白質進行腐敗性分解，破壞青貯飼料營養(yǎng)成分，而降低青貯飼料適口性及營養(yǎng)價值。梭狀芽孢桿菌在厭氧條件下可將青貯飼料中的乳酸或葡萄糖進行丁酸發(fā)酵，而丁酸發(fā)酵的程度是判斷青貯飼料質量好壞的重要標準，丁酸水平越高，青貯飼料品質越差。

α多樣性是指特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內的多樣性，主要用來反映物種豐富度和均勻度及測序深度（Caporaso et al.，2012）。本研究結果顯示，處理2甘蔗尾葉青貯細菌OTU數(shù)目遠高于對照和處理1，其Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著高于對照和處理1，覆蓋指數(shù)與對照相同，略高于處理1。結合各處理優(yōu)勢細菌門、屬的分析結果可知，處理2細菌種群物種多，多樣性水平高，其優(yōu)勢菌屬是非乳酸菌屬，但乳酸菌屬是優(yōu)良青貯飼料的關鍵微生物;同時腐敗菌腸桿菌科未分類菌屬、梭菌科未分類菌屬、梭菌屬IV群和腸桿菌屬占絕對優(yōu)勢，由于腐敗菌未得到抑制而導致OTU數(shù)目遠超對照和處理1。這與王聰（2018）、盧強等（2020）的研究結果相似，均由于腐敗菌未得到有效抑制，導致OTU數(shù)目具有類似趨勢。此外，處理2感官評定中的質地、色澤和氣味得分遠低于對照和處理1，可能也是腐敗菌未得到抑制所致。青貯是一個復雜的微生物發(fā)酵過程，本研究中不同微生物添加劑在青貯過程中與各類微生物的相互競爭繁殖情況有待進一步研究。

4 結論

甘蔗尾葉添加飼用復合微生物制劑進行青貯，其物種數(shù)最豐富，但腐敗菌未得到抑制;甘蔗尾葉添加植物乳桿菌和米曲霉進行青貯可顯著提高甘蔗尾葉青貯細菌群落的繁殖生長，進而提高甘蔗尾葉青貯的微生物多樣性及群落相對豐度，可在甘蔗尾葉青貯中應用。

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