涂 艷，呂寶乾，章雨璐，蔣方一丁，齊可欣

1海南大學(xué)林學(xué)院，海南 儋州 571737；2 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 儋州 571737；3 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省南繁生物安全與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101

椰子織蛾OpisinaarenosellaWalker屬鱗翅目Lepidoptera織蛾科Oecophoridae，原產(chǎn)地為印度和斯里蘭卡，現(xiàn)主要分布于東南亞國(guó)家和地區(qū)，是一種嚴(yán)重危害椰子等30多種棕櫚科植物的害蟲。2013年8月首次在我國(guó)海南發(fā)現(xiàn)(呂寶乾等，2013)。雌蛾產(chǎn)卵于棕櫚葉背面，幼蟲主要取食老葉表皮及葉肉，并在體周構(gòu)造出絲和糞便的甬道，用以躲避天敵、不良環(huán)境等(陸永躍和王敏，2013)。其強(qiáng)大的繁殖能力及防治的困難性，導(dǎo)致在海南等地區(qū)省仍屬高度危險(xiǎn)有害生物(閻偉等，2013)。

目前，對(duì)于椰子織蛾的研究主要集中在生物學(xué)和生態(tài)學(xué)、生物防治等方面(呂寶乾等，2018；吳琦琦等，2018)，在腸道微生物方面卻少有研究。昆蟲腸道系統(tǒng)是伴隨取食、消化、排泄等活動(dòng)而多變的環(huán)境，其微生物種類豐富多樣。微生物在食物消化、生長(zhǎng)發(fā)育、免疫及抵御病原菌方面起著重要作用(梅承等，2018；王四寶和曲爽，2017；Maurice & Navodita，2018；Crottietal.，2012)，一定意義上影響著昆蟲能否在一個(gè)地方快速適應(yīng)、生存并入侵?；谖⑸鷳B(tài)理論，昆蟲缺乏完整的酶系統(tǒng)，需要腸道微生物為食物消化、營(yíng)養(yǎng)吸收和生物代謝提供不同種類的酶(Gandotraetal.，2012)。如夏曉峰(2014)對(duì)小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(L.)中腸道微生物對(duì)纖維素的降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小菜蛾腸道細(xì)菌具有完整的纖維素和果膠降解酶基因，能協(xié)助宿主降解植物細(xì)胞壁中的纖維素、木聚糖和果膠等難降解物質(zhì)。纖維素是一種豐富的碳源，以結(jié)晶或無(wú)定形的微纖維形式存在于植物的細(xì)胞壁中，不容易被宿主吸收，而許多植食性昆蟲的腸道微生物可以參與纖維素的降解(李丹紅等，2017；孫博通等，2017；Chakrabortyetal.,2000)。椰樹老葉相對(duì)新葉含有更多的纖維素，不容易被昆蟲消化利用。椰子織蛾在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，能夠很好地取食利用椰樹等老葉，表明其腸道可能含有降解纖維素的微生物。本文利用傳統(tǒng)生物分離純化培養(yǎng)方法，研究可培養(yǎng)腸道細(xì)菌的種類鑒定及其對(duì)纖維素、果膠、木聚糖等降解能力的分析，以期為后續(xù)深入研究椰子織蛾腸道微生物與宿主的相互作用及相關(guān)微生物資源的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 椰子織蛾的飼養(yǎng)

椰子織蛾(采集于海南省儋州市)置于實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱(A1000, Conviron, Manitoba, Canada)中，飼養(yǎng)溫度為(25±2)℃，RH為(75±10)%，于養(yǎng)蟲盒(25 cm×14 cm×7 cm，盒蓋封有48 μm紗網(wǎng))中飼養(yǎng)2代。

1.2 椰子織蛾腸道的提取

取健康5齡幼蟲提前饑餓24 h，排空體內(nèi)食物殘?jiān)Ｓ跓o(wú)菌操作臺(tái)中，先用無(wú)菌水擦拭清潔幼蟲表體，用75%酒精浸泡30 s做表體消毒后，用無(wú)菌水漂洗3次。在無(wú)菌條件下，用解剖針解剖蟲體，取其腸道，去除其他雜質(zhì)，并放入0.9%生理鹽水中漂洗3次，再加入1 mL無(wú)菌水研磨成勻漿，備用。

1.3 椰子織蛾腸道細(xì)菌的分離純化

將上述提取的腸道勻漿在無(wú)菌條件下按10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12梯度稀釋。各取0.1 mL稀釋液在LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g·L-1、酵母粉提取物5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、瓊脂15 g·L-1、pH=7)上進(jìn)行涂布，再將平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,每24 h觀察一次。根據(jù)菌落的顏色、大小和形態(tài)挑選不同的菌落在新的LB平板上用接種環(huán)劃線純化培養(yǎng)，每個(gè)菌落在平板上至少純化5次，得到單克隆菌株，純化得到的菌株接種至斜面培養(yǎng)基，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 椰子織蛾分離細(xì)菌16S rRNA的擴(kuò)增

將分離純化得到的細(xì)菌樣本送至青島派森諾基因生物技術(shù)有限公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序。細(xì)菌PCR擴(kuò)增引物為16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)。PCR反應(yīng)體系：基因組DNA(20 ng·μL-1)1.0 μL、10×Buffer(含2.5 mg·mol-1Mg2+)5.0 μL、Taq聚合酶(5 U·μL-1)1.0 μL、dNTP(10 mg·mol-1)1.0 μL、27F引物(10 μg·mol-1)1.5 μL、1492R引物(10 μg·mol-1)1.5 μL、ddH2O 39.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，90 s；72 ℃，7 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段。取各個(gè)菌種純化后的PCR產(chǎn)物，使用測(cè)序儀ABI3730-XL進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.5 椰子織蛾腸道細(xì)菌的菌種測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析

用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI(16s數(shù)據(jù)庫(kù))中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得到與待測(cè)物種序列相似性最大的物種信息，確定菌種鑒定結(jié)果。并采用革蘭氏染色制片的方法于光學(xué)顯微鏡下觀察獲取其顯微形態(tài)。

選取單克隆菌株的近緣序列，利用MEGA7.0軟件以鄰位相連算法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 椰子織蛾腸道可培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)纖維素、果膠及木聚糖的降解功能分析

(1)將分離純化得到的菌株分別接到纖維素篩選平板(羧甲基纖維素鈉10 g·L-1，蛋白胨1 g·L-1，(NH4)2SO24 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，K2HPO42 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.4 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH=7.0)、木聚糖篩選平板(木聚糖8 g·L-1，酵母粉1 g·L-1，(NH4)2SO24 g，K2HPO42 g·L-1，NaCl 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH=7.0)、果膠素篩選平板(果膠粉10 g·L-1，酵母粉1 g·L-1，(NH4)2SO24 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.4 g·L-1，F(xiàn)eSO40.01 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH=7.0)上。將各平板倒置于恒溫箱培養(yǎng)，30 ℃，培養(yǎng)72 h。

(2)將能在上述平板上生長(zhǎng)的菌株分別接至纖維素酶鑒定平板(羧甲基纖維素鈉5 g·L-1，(NH4)2SO22 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，K2HPO42 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，CaCl20.1 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH=7.0)、木聚糖酶鑒定平板(木聚糖5 g·L-1，(NH4)2SO22 g·L-1，K2HPO42 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH=7.0)、果膠酶鑒定平板(果膠粉5 g·L-1，(NH4)2SO22 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，NaNO33 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，F(xiàn)eSO40.01 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH=7.0)上。將各平板置于恒溫箱培養(yǎng)，30 ℃，培養(yǎng)7 d，采用透明圈法對(duì)相關(guān)酶的產(chǎn)生菌進(jìn)行鑒定。

纖維素酶產(chǎn)生菌的鑒定：在長(zhǎng)出菌落的纖維素酶鑒定平板上，加入適量的0.1%剛果紅溶液染色10 min后，以1 mol·L-1NaCl脫色5 min, 觀察菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈(背景為紅色)；木聚糖酶產(chǎn)生菌的鑒定：在長(zhǎng)出菌落的木聚糖酶鑒定平板上，加入適量的盧戈碘液染色5 min后，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈(背景為紫色)。果膠酶產(chǎn)生菌的鑒定：在長(zhǎng)出菌落的果膠酶鑒定平板上，加入適量的0.1%溴酚藍(lán)染色5 min后，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生黃色透明圈(背景為褐色)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道細(xì)菌分離純化及基因測(cè)序

將椰子織蛾的腸道內(nèi)容物按一定濃度涂布在LB培養(yǎng)基上，獲得腸道原始菌株。分別從上述培養(yǎng)基中挑選形態(tài)、大小、顏色不一的菌落進(jìn)行分離純化，共得到待測(cè)的細(xì)菌菌落。將所得菌落進(jìn)行DNA提取，以提取的基因?yàn)槟０鏀U(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序，用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI 16S數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，分離后的可培養(yǎng)菌株主要為高雄假黃單胞菌Pseudoxanthomonaskaohsiungensis(NR_043070.1)(99.71%)、伯克霍爾德氏菌Burkholderialata(NR_102890.1)(99.74%)、蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus(NR_115714.1)(99.73%)、沙福芽孢桿菌Bacillussafensis(NR_113945.1)(100%)、解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens(NR_116022.1)(100.00%)、貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezensis(NR_075005.2)(98.44%)、山羊葡萄球菌Staphylococcuscaprae(NR_119252.1)(99.93%)、寒氣玫瑰單胞菌Roseomonasaerofrigidensis(NR_158137.1)(98.84%)、微桿菌Microbacteriumesteraromaticum(NR_026468.1)(99.20%)9種菌株。

2.2 菌株的顯微形態(tài)

對(duì)以上菌株采用革蘭氏染色制片，在顯微鏡下觀察并獲得其顯微形態(tài)(圖1)，高雄假黃單胞菌、伯克霍爾德氏菌、寒氣玫瑰單胞菌革蘭氏染色呈紅色,為革蘭氏陰性菌株，其余均為紫色革蘭氏陽(yáng)性菌株；顯微形態(tài)下可知，除山羊葡萄球菌為球狀結(jié)構(gòu)外,其余均為桿狀結(jié)構(gòu)，其中高雄假黃單胞菌呈微彎曲桿狀，微桿菌在培養(yǎng)后期呈桿狀球狀相間。

圖1 菌株的顯微形態(tài)

2.3 椰心葉甲、椰子織蛾腸道微生物組間豐度差異顯著性檢驗(yàn)

將測(cè)序比對(duì)得到的上述菌株的16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖2),結(jié)果顯示,椰子織蛾腸道可分離培養(yǎng)細(xì)菌在進(jìn)化樹上形成不同分支。其中，高雄假黃單胞菌、伯克霍爾德氏菌屬于變形菌門Proteobacteria分支，假黃單胞菌為γ-變形菌綱，伯克霍爾德氏菌屬于β-變形菌綱。蠟樣芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、山羊葡萄球菌則組成了厚壁菌門Phylum Firmicutes的分支。微桿菌則屬于放線菌門Actinobacteria。

圖2 椰子織蛾幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4 椰子織蛾腸道細(xì)菌功能分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,有4種菌株對(duì)纖維素具有降解能力，分別為伯克霍爾德氏菌、解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌(圖3)。各菌株都不具備降解果膠的能力或暫未在可培養(yǎng)菌株中發(fā)現(xiàn)。有2種菌株具有降解木聚糖的能力，分別為寒氣玫瑰單胞菌和解淀粉芽孢桿菌(圖4)。其中，解淀粉芽孢桿菌既具有降解纖維素的能力也有降解木聚糖的能力。

圖3 椰子織蛾腸道細(xì)菌菌株對(duì)纖維素降解能力

圖4 椰子織蛾腸道細(xì)菌菌株對(duì)木聚糖降解能力

3 討論

本文分離培養(yǎng)鑒定得到的9株細(xì)菌與近年來(lái)研究所得可分離培養(yǎng)的昆蟲腸道微生物細(xì)菌大致一致，分別屬于常見(jiàn)的厚壁菌門(6種)、變形菌門(2種)和放線菌門(1種)，也正表明厚壁菌門和變形菌門為許多昆蟲腸道微生物中的優(yōu)勢(shì)種(藍(lán)波妙,2016; 劉小改等,2016; 楊焊,2012)。

前人研究表明，昆蟲腸道微生物對(duì)昆蟲取食消化、營(yíng)養(yǎng)利用等方面的影響較大，如木食性白蟻和蟑螂后腸的共生微生物幫助宿主固氮、轉(zhuǎn)化含氮廢棄物尿酸為可利用的氮源，參與纖維素的降解等(Brune,2014)。纖維素、半纖維素等高產(chǎn)高效降解菌株的尋找與研究一直是科研的熱點(diǎn)，纖維素降解菌株在農(nóng)業(yè)、能源、環(huán)保等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著巨大的作用。昆蟲已經(jīng)進(jìn)化出內(nèi)源性和共生酶，以有效利用木質(zhì)纖維素材料作為代謝葡萄糖的來(lái)源(Willisetal.,2010)。纖維素是世界上豐富的可再生資源，但對(duì)其利用及能源轉(zhuǎn)化一直未能得到很好解決，纖維素降解酶的活性低及成本高等問(wèn)題限制著其工業(yè)生產(chǎn)。劉松等(2017)通過(guò)對(duì)竹蟲OmphisafuscidentalisHampson腸道微生物代謝通路分析及對(duì)纖維素降解酶菌株的分離來(lái)創(chuàng)造更多的纖維素分解生物資源，張科等(2020)從蟋蟀后腸中分離出多株纖維素降解細(xì)菌。本文所研究的椰子織蛾主要取食棕櫚科植物老葉，其葉片中纖維素、木聚糖等難降解物質(zhì)占比高，而腸道微生物則一定程度上與降解這些物質(zhì)相關(guān)。因而本實(shí)驗(yàn)從椰子織蛾腸道中分離培養(yǎng)出多株具有降解纖維素或木聚糖能力的菌株，表明腸道細(xì)菌在昆蟲取食消化上的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同菌株降解透明圈有一定差異，采用基礎(chǔ)的透明圈與菌株菌落直徑比較的方法來(lái)判斷降解能力，其中，貝萊斯芽孢桿菌降解纖維素的能力顯著較強(qiáng)，解淀粉芽孢桿菌對(duì)木聚糖的降解情況良好并且同時(shí)能降解纖維素，這與郭天凱(2019)等從柞蠶AnthereapernyiGuerin-Meneville腸道菌中篩選鑒定出產(chǎn)纖維素酶活性較高的菌株屬于解淀粉酶芽孢桿菌屬相符。本實(shí)驗(yàn)中所得到的具纖維素降解酶菌株的大量生產(chǎn)及降解活性的測(cè)定則希望能通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)解決。

本文利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)與分離的方法對(duì)椰子織蛾幼蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)和分離。微生物能做到傳統(tǒng)分離培養(yǎng)，但傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和技術(shù)在一定意義上無(wú)法滿足微生物在自然生態(tài)條件下對(duì)環(huán)境因子、營(yíng)養(yǎng)要素和物種間相互作用等方面的要求(袁志輝等,2014)，尤其是對(duì)與動(dòng)植物之間具有復(fù)雜共生關(guān)系的微生物則更加困難(Westetal.,2007)。由于對(duì)大多數(shù)微生物與椰子織蛾腸道之間的共生機(jī)制的認(rèn)識(shí)不足，無(wú)法模擬其共生環(huán)境的自然因素，導(dǎo)致很多微生物沒(méi)有被分離培養(yǎng)出來(lái)。通過(guò)對(duì)比可發(fā)現(xiàn)，目前的可培養(yǎng)菌株僅是其腸道內(nèi)微生物的極小部分，后續(xù)研究可通過(guò)繼續(xù)尋找、優(yōu)化培養(yǎng)方法來(lái)發(fā)現(xiàn)其更多的可培養(yǎng)菌株,也可通過(guò)宏基因組分析等方法獲得更全面的腸道微生物組成。