晁毛妮 胡海燕,* 王潤豪 陳 煜 付麗娜 劉慶慶 王清連

陸地棉鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因啟動(dòng)子的克隆與功能分析

晁毛妮1胡海燕1,*王潤豪1陳 煜2付麗娜1劉慶慶1王清連1

1河南科技學(xué)院/ 現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南新鄉(xiāng) 453003;2山東棉花研究中心, 山東濟(jì)南 250100

KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物響應(yīng)低鉀脅迫的一項(xiàng)重要機(jī)制?？寺『头治雒藁ㄢ涋D(zhuǎn)運(yùn)體基因的啟動(dòng)子, 不僅有助于了解其表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制, 對于改良棉花的鉀吸收特性也具有重要意義。陸地棉鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因是一個(gè)在根中特異性高表達(dá)的基因, 其表達(dá)受低鉀脅迫誘導(dǎo), 目前關(guān)于該基因啟動(dòng)子的功能還不清楚。本研究以陸地棉品種百棉1號(hào)為材料, 通過PCR方法對上游2000 bp啟動(dòng)子片段(pGhHAK5)進(jìn)行克隆, 并通過轉(zhuǎn)化擬南芥、GUS組織定位和低鉀誘導(dǎo)表達(dá)特性分析來研究其功能。結(jié)果表明, pGhHAK5除具有TATA-box和CAAT-box等基本順式作用元件外, 還含有多個(gè)響應(yīng)于光、逆境脅迫、植物激素和生物鐘等的順式作用元件。pGhHAK5與雷蒙德氏棉pGrHAK5在重要調(diào)控元件的數(shù)量和位置分布上具有較高的一致性, 均具有5個(gè)參與根特異性表達(dá)調(diào)控的元件(ATAAAAT)和1個(gè)參與低鉀條件下轉(zhuǎn)錄調(diào)控的ARF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TGTCNN)。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的葉脈和胚軸維管束組織染色較深, 根系染色較淺; 成熟期轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的根、葉脈和花萼維管束組織染色較深, 莖和莢皮染色較淺, 表明pGhHAK5驅(qū)動(dòng)的主要在擬南芥成熟的根和地上部維管束組織中表達(dá)。進(jìn)一步低鉀誘導(dǎo)表達(dá)特性分析表明, PGhHAK5驅(qū)動(dòng)的在擬南芥幼苗幼嫩根中的表達(dá)很弱, 且其表達(dá)不受低鉀脅迫誘導(dǎo)而增強(qiáng), 表明PGhHAK5可能是一個(gè)主要在成熟根中具有功能的低鉀誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄組分析和熒光定量PCR結(jié)果表明,主要在成熟的根中表達(dá), 且其表達(dá)受發(fā)育時(shí)期的影響, 該結(jié)果與pGhHAK5驅(qū)動(dòng)的在擬南芥根中的表達(dá)結(jié)果一致。本研究結(jié)果有助于深入了解表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制, 并為棉花鉀吸收效率的提高及鉀高效棉花品種的培育提供理論依據(jù)。

啟動(dòng)子; 維管束組織; 鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體; 低鉀; 陸地棉

棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物, 也是鉀敏感作物[1]。據(jù)估計(jì), 我國耕地有1/4~1/3的土壤缺鉀或嚴(yán)重缺鉀[2], 土壤缺鉀不僅會(huì)影響棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)的形成, 也是引起棉花早衰的重要原因之一[3-8]。研究表明, 植物可以通過提高自身的鉀吸收效率或調(diào)整內(nèi)源鉀的再分配與利用來適應(yīng)外界的低鉀環(huán)境[9], 該過程主要通過鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體和鉀離子通道蛋白兩大鉀轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來完成[10-11]。近年來, 對鉀轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因的研究已成為提高作物鉀吸收特性和培育鉀高效作物品種的一條新途徑。

KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體是植物鉀轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)較早發(fā)現(xiàn)的一個(gè)基因家族, 其成員在介導(dǎo)植物對K+的高親和性吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)與分配等方面都起著關(guān)鍵作用[12-13]。是擬南芥KUP/HAK/KT家族成員之一, 其表達(dá)受低鉀脅迫誘導(dǎo), 也被認(rèn)為是擬南芥響應(yīng)鉀缺乏的標(biāo)志性基因[12]。作為擬南芥KUP/HAK/ KT家族中唯一的能在低于10 μmol L–1鉀濃度環(huán)境下參與鉀吸收的高親和性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因[13], 目前關(guān)于表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制已開展許多研究。研究者們發(fā)現(xiàn),啟動(dòng)子區(qū)特定的順式作用元件會(huì)與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來調(diào)控該基因的表達(dá), 使植物更好地適應(yīng)外界低鉀環(huán)境[14-15]。例如, 轉(zhuǎn)錄因子ARF2通過與啟動(dòng)子區(qū)生長素響應(yīng)元件結(jié)合來抑制的表達(dá), 并可通過低鉀引起的ARF2磷酸化來解除其對表達(dá)的抑制, 使其在低鉀條件下被誘導(dǎo)并大量表達(dá)[14]; 同樣地, 轉(zhuǎn)錄因子RAP2.11可通過與啟動(dòng)子區(qū)ERE結(jié)構(gòu)域和GCC-box位點(diǎn)結(jié)合來正向調(diào)控在低鉀條件下的表達(dá)[15]。的表達(dá)除受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控外, 近年來研究發(fā)現(xiàn)激酶CIPK23能磷酸化AtHAK5蛋白的N端, 并在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控AtHAK5蛋白的活性, 增強(qiáng)其對環(huán)境中鉀的吸收能力[16]。這些研究表明, 鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的表達(dá)調(diào)控在植物適應(yīng)外界低鉀脅迫方面發(fā)揮著重要作用。

啟動(dòng)子對于基因的表達(dá)調(diào)控至關(guān)重要, 其包含的順式作用元件種類和數(shù)量會(huì)影響基因的表達(dá)模式和強(qiáng)度[17]。因此, 克隆和分析基因的啟動(dòng)子, 有助于了解其表達(dá)模式及表達(dá)調(diào)控機(jī)制。陸地棉鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因是擬南芥的同源基因, 其CDS序列已被克隆, 關(guān)于其序列特征和表達(dá)特性已進(jìn)行了初步研究[18], 然而, 關(guān)于該基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究尚很少開展。本研究以陸地棉品種百棉1號(hào)為材料, 對基因啟動(dòng)子2000 bp片段pGhHAK5進(jìn)行克隆和順式作用元件分析。為了研究pGhHAK5啟動(dòng)子的功能, 構(gòu)建了融合表達(dá)載體pGhHAK5::GUS并轉(zhuǎn)化擬南芥, 通過對轉(zhuǎn)pGhHAK5擬南芥植株進(jìn)行GUS組織定位和低鉀誘導(dǎo)表達(dá)特性分析來探索基因的表達(dá)調(diào)控模式。研究結(jié)果不僅有助于闡明鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制, 也可為棉花的鉀營養(yǎng)性狀的改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與植株培養(yǎng)

試驗(yàn)材料陸地棉品種百棉1號(hào)由河南科技學(xué)院棉花課題組提供, 用于基因啟動(dòng)子2000 bp片段pGhHAK5的克隆和表達(dá)特性的分析。

將百棉1號(hào)種植于河南科技學(xué)院光照培養(yǎng)室, 光照強(qiáng)度為450 μmol m–2s–1, 光周期為(30~33)℃/ 14 h光照, (23~26)℃/10 h黑暗。挑選整齊一致且飽滿的棉花脫絨種子于濕沙中萌發(fā)和出苗, 待子葉展開后轉(zhuǎn)移至1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液[19]中培養(yǎng)。在棉花幼苗生長24、48、72、96、120 h及子葉期和四片真葉期時(shí), 分別取棉花植株的根和葉, 速凍于液氮中并保存于-80℃冰箱, 以供用于基因不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性分析。

1.2 DNA的提取及pGhHAK5擴(kuò)增

以幼嫩的百棉1號(hào)根系為材料, 按照DNA提取試劑盒(TIANGEN, DP321)說明書提取基因組DNA。根據(jù)pGhHAK5的序列信息, 利用Primer5.0設(shè)計(jì)引物, 引物序列為pGhHAK5-F: 5￠-TTCACGCCCATCTT TATCTC-3￠; pGhHAK5-R: 5￠-TCAACGTCCTTATCC AATCC-3￠。PCR體系50 μL, 包括10 μL 5× Prime STAR GXL buffer (Mg2+plus)、4.0 μL 2.5 mmol L–1dNTPs、10 mmol L–1正反向引物各1.5 μL、1 μL 1.2 U μL–1PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (TaKaRa, R050A)、5.0 μL DNA模板和27.0 μL ddH2O。PCR程序?yàn)?4°C 5 min; 94°C 30 s, 65°C 2.5 min, 32個(gè)循環(huán); 72°C 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 確定為目的基因的經(jīng)膠回收試劑盒(Axygen, AP-GX-4)回收后送華大基因公司測序。

1.3 序列分析

利用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線分析啟動(dòng)子的順式作用元件。從Phyzotome網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/ portal.html)下載擬南芥(AT4G13420.1)、水稻(LOC_Os04g3292 0.1)、毛果楊(POPTR_0001s03680)ATG上游2000 bp的啟動(dòng)子序列; 從Cottongen網(wǎng)站(https://www.cottongen.org/)下載海島棉(GB_D01G 2145)、雷蒙德氏棉(Gorai.002G213000.1)和亞洲棉(Ga02G1270)ATG上游2000 bp的啟動(dòng)子序列。利用Clustal軟件進(jìn)行序列比對后, 使用Bioedit 7.0軟件分析序列間的相似性。

1.4 基因表達(dá)特性分析

不同生長發(fā)育時(shí)間點(diǎn)(幼苗生長24、48、72、96、120 h及4片真葉期)棉花組織(根和葉)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載于NCBI網(wǎng)站SRA (Sequence read archive)數(shù)據(jù)庫(SRA: PRJNA248163[20])。使用軟件cufflinks (Version 2.1.1)的FPKM (Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)方法來計(jì)算基因的表達(dá)量[21]。

采用熒光定量PCR (qRT-PCR)的方法進(jìn)一步分析的表達(dá)特性, 內(nèi)參基因?yàn)槊藁ńM成型表達(dá)基因(GenBank登錄號(hào)為AY907703.1)。內(nèi)參基因和基因的熒光定量PCR引物序列為GhHAK5-F: 5'-GTAAGGACGGGTGGATA-3'; GhHA K5-R: 5'-AGTAAAGCAGGCAAGGTA-3'; Actin-F: 5'-GACCGCATGAGCAAGGAGAT-3'; Actin-R: 5'- GCTGGAAGGTGCTGAGTGAT-3'。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板, 于BIOER熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT- PCR。反應(yīng)體系包括2× SYBR Premix Ex(TaKaRa, RR820L)10 μL、10 mmol L–1正反向引物各0.8 μL、1 μL cDNA模板和7.4 μL ddH2O, 共計(jì)20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5°C 30 s; 95°C 5 s, 60°C 20 s, 40個(gè)循環(huán)后增加熔解曲線。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù), 采用2–ΔΔCt法[22]計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.5 載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化

選用pCAMBIA1381Z(含有基因, 不含啟動(dòng)子)作為表達(dá)載體。首先, 根據(jù)啟動(dòng)子2000 bp的序列設(shè)計(jì)特異性引物, 引物序列為pGhHAK5- GUS-F: 5￠-CATGATTGATTTCAAAAAAA AAATGATATG-3' (下畫線為內(nèi)切酶I的識(shí)別序列); pGhHAK5-GUS-R: 5'-CATGAAGTT GCGATGACGGTGAG-3' (下畫線為內(nèi)切酶I的識(shí)別序列)。接著, 通過PCR擴(kuò)增將酶切位點(diǎn)I引入pGhHAK5的上下游。對PCR回收產(chǎn)物和載體pCAMBIA1381Z分別用內(nèi)切酶I進(jìn)行酶切并膠回收, 載體膠回收產(chǎn)物再用去磷酸化酶CIAP (2250A, Takara)進(jìn)行去磷酸化并膠回收, 載體酶切并去磷酸化后的膠回收產(chǎn)物和PCR酶切后的膠回收產(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng), 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α, 涂布含有卡納霉素的LB抗性平板, 37℃培養(yǎng)12 h后, 挑取單克隆, 并進(jìn)行菌液PCR檢測。檢測為陽性的菌液提取質(zhì)粒后進(jìn)行進(jìn)一步的酶切驗(yàn)證, 將含有目的基因片段的菌液送華大基因公司測序。最后, 將測序結(jié)果與目標(biāo)序列比對, 序列一致且目的片段連入方向正確的菌液提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法[23]將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(Cloumbia-0), 獲得T0代轉(zhuǎn)基因種子。

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選和鑒定

將收獲的T0代轉(zhuǎn)基因種子種在含有潮霉素抗性的MS培養(yǎng)基上篩選, 經(jīng)抗性篩選長出的植株為T1代植株, 待T1代植株長出兩片真葉后移栽到蛭石中, 在光照培養(yǎng)箱(22℃, 光16 h/暗8 h)中培養(yǎng)。于幼苗期取T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的葉片, 用于進(jìn)一步PCR檢測, 檢測為陽性的植株于成熟期收獲T1代種子。PCR檢測方法如下, 首先, 通過DNA提取試劑盒(Tiangen, DP321)提取轉(zhuǎn)基因擬南芥植株和野生型擬南芥(陰性對照)葉片DNA; 然后, 利用目的基因特異性引物F: 5'-ATTGATTTCAAAAAAAAAATG ATATG-3', R: 5'-AAGTTGCGATGACGGTGAGAAA TG-3', 以葉片DNA和表達(dá)載體pCAMBIA1381Z- pGhHAK5質(zhì)粒(陽性對照)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%脂糖凝膠電泳檢測后, 根據(jù)檢測結(jié)果鑒定目標(biāo)啟動(dòng)子片段是否插入擬南芥基因組DNA中。以同樣方法繼續(xù)對T1代種子進(jìn)行潮霉素抗性篩選和PCR檢測, 收獲的T2代種子用于后續(xù)的pGhHAK5功能分析。

1.7 擬南芥幼苗的低鉀處理

將轉(zhuǎn)基因擬南芥種子春化、消毒后分別播種在正常(MS)和低鉀(LK, 100 μmol L–1K+)培養(yǎng)基上[24], 然后于相同條件的光照培養(yǎng)箱(22℃, 光16 h/暗8 h)中培養(yǎng), 生長2周后, 取整株擬南芥幼苗進(jìn)行GUS染色。

1.8 GUS組織化學(xué)染色

參照J(rèn)efferson等[25]的方法略加修改, 取擬南芥幼苗和成熟期擬南芥植株的根、葉片、莖、花和莢等組織, 加入GUS染色液, 于37℃溫育過夜24 h, 用70%乙醇脫色, 直至底色完全消失, 在體視顯微鏡(AXIO Zoom.V16, 蔡司)下觀察染色結(jié)果并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhHAK5基因啟動(dòng)子的克隆

以先前克隆的位于陸地棉D(zhuǎn)亞組的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因[18]ID號(hào)Gh_D01G1760檢索陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫[20], 得到其起始密碼子ATG上游2000 bp的啟動(dòng)子序列。在該目標(biāo)序列的上下游約500 bp范圍內(nèi)設(shè)計(jì)1對特異性引物, 以百棉1號(hào)DNA為模板, 通過PCR方法對啟動(dòng)子2000 bp片段pGhHAK5進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增片段的理論大小為2600 bp, 由圖1可以看出, PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果與預(yù)期的片段大小相符。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后與陸地棉TM-1基因組數(shù)據(jù)庫pGhHAK5參考序列比對分析表明, 克隆的2600 bp序列包含完整的目標(biāo)pGhHAK5片段, 且與TM-1基因組參考序列一致, 表明已成功克隆基因上游2000 bp的啟動(dòng)子序列。

2.2 pGhHAK5順式作用元件預(yù)測與分析

利用在線啟動(dòng)子元件預(yù)測工具PlantCARE對pGhHAK5進(jìn)行順式作用元件分析, 發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子除具有CAAT-box和TATA-box等啟動(dòng)子基本核心元件外, 還包括1個(gè)提高轉(zhuǎn)錄水平的5' UTR Py-rich stretch元件、5個(gè)參與光響應(yīng)的元件(Box I、I-box、G-Box、AT1-motif和Box II 2)、1個(gè)生物鐘調(diào)控元件(circadian)、4個(gè)參與植物激素響應(yīng)的元件(包括1個(gè)水楊酸響應(yīng)元件TCA-element, 1個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件CGTCA-motif, 1個(gè)生長素響應(yīng)元件TGA-element和1個(gè)乙烯響應(yīng)元件ERE)、5個(gè)逆境脅迫響應(yīng)元件(包括4個(gè)熱脅迫響應(yīng)元件HSE和1個(gè)真菌誘導(dǎo)子元件Box-W1); 另外, 還包括4個(gè)胚乳表達(dá)相關(guān)順式作用調(diào)控元件(Skn-1_motif)、1個(gè)AT-rich DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)(AT-rich element)和5個(gè)根特異性表達(dá)響應(yīng)元件[26]等其他類順式作用元件(表1和圖2)。這些結(jié)果表明基因的表達(dá)可能受光、植物激素、逆境脅迫和生物鐘等外界環(huán)境條件的調(diào)控。

圖1 陸地棉啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增

Fig. 1 Amplification ofpromoter sequence in upland cotton (L.)

1:啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; 2: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)。

1: PCR products ofpromoter; 2: DNA marker (DL2000).

2.3 GhHAK5與其同源基因啟動(dòng)子序列的比較分析

為了深入了解的表達(dá)調(diào)控特性, 對及其同源基因包括擬南芥、水稻、毛果楊、四倍體棉種海島棉以及二倍體祖先棉種雷蒙德氏棉(D5)和亞洲棉(A2)基因ATG上游2000 bp的啟動(dòng)子序列比較分析。表明pGhHAK5具有5個(gè)根特異性表達(dá)調(diào)控的元件(ATAAAAT)[26](圖3), 暗示著可能是一個(gè)在根中特異性高表達(dá)的基因。是一個(gè)在根中特異性高表達(dá)的基因(數(shù)據(jù)來源于Phyzotome網(wǎng)站), 與pGhHAK5一樣, pPtHAK5.1也具有5個(gè)根特異性表達(dá)調(diào)控元件(圖3)。另外, pGhHAK5含有1個(gè)參與低鉀條件下轉(zhuǎn)錄調(diào)控的ARF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)[27](TGTCNN), 但是不含有參與低鉀條件下表達(dá)調(diào)控的RAP2.11轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)GCC-box[15](圖3)。說明pGhHAK5的表達(dá)可能受低鉀脅迫調(diào)控, 但是可能具有和其他植物不一樣的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。進(jìn)一步對棉屬4個(gè)種基因啟動(dòng)子序列比較分析發(fā)現(xiàn), pGhHAK5與雷蒙德氏棉pGrHAK5在重要調(diào)控元件數(shù)量和位置分布上具有較高的一致性, 均含有5個(gè)根特異性表達(dá)調(diào)控元件和1個(gè)ARF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖3), 且兩者啟動(dòng)子間的序列相似性達(dá)87.7%; 與海島棉pGbHAK5在元件數(shù)量和分布上差異次之, 且兩者啟動(dòng)子間的序列相似性達(dá)68.9%, 與亞洲棉pGaHAK5在元件數(shù)量和分布上差異最大, 且兩者啟動(dòng)子間序列相似性達(dá)40.5% (圖3)。陸地棉是一個(gè)位于D亞組的基因, 陸地棉pGhHAK5與二倍體祖先種雷蒙德氏棉(D5)pGrHAK5在核心元件數(shù)量和位置上具較高的一致性, 表明棉花啟動(dòng)子區(qū)重要的調(diào)控元件或位點(diǎn)在物種進(jìn)化過程中可能是保守的。

表1 GhHAK5啟動(dòng)子區(qū)包含的順式作用元件

圖2 GhHAK5啟動(dòng)子的序列分析

核苷酸的+1位置指的是起始密碼子ATG中的A的位置, ATG用紅色表示。部分預(yù)測的順式作用元件在圖中用灰色陰影表示。1個(gè)ARF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TGTCNN)在圖中用紅色加下畫線表示。5個(gè)根特異性表達(dá)元件(ATAAAAT)在圖中用紅色加粗表示。

The nucleotide at position +1 is the ATG start codon, the ATG is indicated in red. Parts of the putative-regulatory elements are noted under the sequences in shadow. The one ARF binding site (TGTCNN) is underlined in red, and the five root-specific motifs are bold in red.

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株的鑒定

將2000 bp的啟動(dòng)子片段pGhHAK5通過單酶切法(I)構(gòu)建到含有基因的表達(dá)載體pCAMBIA1381Z (有GUS, 無啟動(dòng)子)上, 并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(Cloumbia-0), 成熟后收獲T0代種子, 經(jīng)含有潮霉素MS培養(yǎng)基篩選后, 進(jìn)一步對T1代擬南芥幼苗進(jìn)行PCR檢測。由圖4可知, T1代擬南芥幼苗和表達(dá)載體pCAMBIA1381Z-pGhH AK5質(zhì)粒均能擴(kuò)增到2000 bp的目標(biāo)條帶pGhHAK5, 而野生型擬南芥沒有擴(kuò)增到目標(biāo)條帶, 表明本研究檢測的T1代擬南芥幼苗為陽性植株, 成熟后收獲T1代種子, 經(jīng)含有潮霉素MS培養(yǎng)基篩選和PCR檢測, 成熟后收獲的T2代種子用于后續(xù)的功能分析。

2.5 pGhHAK5的功能分析

對轉(zhuǎn)pGhHAK5擬南芥植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色, 結(jié)果pGhHAK5驅(qū)動(dòng)的主要在轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的葉脈(圖5-B1, B2)和胚軸維管束組織(圖5-B1, B3)中表達(dá), 在根(圖5-B1, B4)中表達(dá)量較低, 而野生型擬南芥幼苗的各個(gè)組織均無染色(圖5-A1~A4)。先前研究發(fā)現(xiàn)是一個(gè)在根中特異性高表達(dá)的基因[18], 為了探究pGhHAK5驅(qū)動(dòng)在根中的表達(dá)是否受發(fā)育時(shí)期影響, 本研究進(jìn)一步對成熟期擬南芥植株的根、葉片、莖、花和莢等組織進(jìn)行GUS染色。結(jié)果轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉脈(圖5-B5)、根(圖5-B11, B12)和花萼維管束組織(圖5-B7, B8)均染色較深, 莖(圖5-B6)和莢皮(圖5-B9, B10)染色較淺; 野生型擬南芥的葉片(圖5-A5)、莖(圖5-A6)、花(圖5-A7, A8)、莢(圖5-A9, A10)和根(圖5-A11, A12)均沒染色。說明pGhHAK5驅(qū)動(dòng)主要在轉(zhuǎn)基因擬南芥成熟的根和地上部維管束組織中表達(dá), 且在擬南芥根中的表達(dá)受發(fā)育時(shí)期的影響。

圖3 GhHAK5同源基因啟動(dòng)序列的比較分析

加粗的為棉屬4個(gè)種鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的啟動(dòng)子。

The promoter of potassium transporter geneof four species inare indicated in bold.

圖4 T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的PCR檢測

M: marker; 1: 野生型擬南芥(陰性對照); 2: 表達(dá)載體pCAMBIA1381Z-pGhHAK5質(zhì)粒(陽性對照); 3~8轉(zhuǎn)基因擬南芥。

M: marker; 1: wild(negative control); 2: expression vector pCAMBIA1381Z-pGhHAK5 plasmid (positive control); 3–8: transgenic.

2.6 低鉀脅迫對轉(zhuǎn)pGhHAK5擬南芥幼苗GUS表達(dá)的影響

為了探究pGhHAK5驅(qū)動(dòng)的在轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗根中微弱的表達(dá)是否會(huì)受低鉀脅迫誘導(dǎo)而增強(qiáng), 對轉(zhuǎn)pGhHAK5擬南芥幼苗進(jìn)行低鉀脅迫處理。結(jié)果與正常供鉀(HK)水平相比, 低鉀(LK)處理后pGhHAK5驅(qū)動(dòng)在擬南芥幼苗根中的微弱表達(dá)并未顯著增強(qiáng)(圖6), 表明PGhHAK5驅(qū)動(dòng)的在擬南芥幼苗的幼嫩根中的表達(dá)不受低鉀脅迫誘導(dǎo), 這可能是植株處于幼苗期時(shí), 植物本身對外界環(huán)境中鉀元素需求量比較低的緣故。這些研究結(jié)果表明本研究克隆的pGhHAK5可能是一個(gè)主要在成熟根中具有功能的低鉀誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

2.7 GhHAK5基因的時(shí)空表達(dá)特性分析

為了驗(yàn)證pGhHAK5的功能, 對的時(shí)空表達(dá)特性研究表明, 在棉花幼苗發(fā)育前5 d (生長24~ 120 h),在根中表達(dá)量很低; 在棉花四片真葉期, 與發(fā)育前5 d相比,在根中的表達(dá)量迅速上升, 在葉片中的表達(dá)量一直很低(圖7-A)。進(jìn)一步熒光定量PCR分析表明, 在棉花四片真葉期,在根中的表達(dá)量迅速升高, 而在葉片中的表達(dá)量一直處于較低水平(圖7-B), 該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相一致。另外, 與子葉期幼嫩的根相比(圖7-C),在四葉期根中表達(dá)要顯著高于其在子葉期幼嫩根中的表達(dá)(圖7-B)。這些結(jié)果表明在根中的表達(dá)受發(fā)育時(shí)期的影響, 該結(jié)果與轉(zhuǎn)pGhHAK5擬南芥植株根系GUS染色結(jié)果相一致; 另外, 本研究觀察到的在葉片中較低的表達(dá)也與基因是一個(gè)主要在根中負(fù)責(zé)外界環(huán)境中鉀離子吸收的功能相一致。

圖5 轉(zhuǎn)pGhHAK5擬南芥植株的GUS組織化學(xué)染色

A: 野生型擬南芥; B: 轉(zhuǎn)pGhHAK5擬南芥; 1~4: 擬南芥幼苗(1)及其葉片(2)、胚軸(3)和根(4)對應(yīng)位置放大圖; 5~12: 成熟期擬南芥植株的葉片(5)、莖(6)、花(7)、花對應(yīng)位置放大圖(8)、莢(9)、莢對應(yīng)位置放大圖(10)、根(11)和根對應(yīng)位置放大圖(12)。

A: wild-typeseedlings; B: pGhHAK5 transgenic; 1–4:seedlings (1) and enlarged view of its leaf (2), hypocotyl (3) and roots (4); 5–12: the leaf (5), stem (6), flower (7), enlarged view of flower (8), pod (9), enlarged view of pod (10), roots (11), and enlarged view of roots (12) in mature period

3 討論

KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體家族, 對植物鉀營養(yǎng)的吸收具有重要作用。由于土壤中鉀離子的濃度往往低于植物生長發(fā)育所需的濃度, 植物常常處于低鉀環(huán)境[28]。已有研究發(fā)現(xiàn), 許多高親和性的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因, 例如擬南芥[29]以及其同源基因大麥[30]、番茄[31]、水稻[32]和陸地棉[18]等, 它們的表達(dá)均受低鉀條件誘導(dǎo)。研究這些基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制, 并通過基因工程手段提高這些基因的表達(dá)水平, 對于提高植物的鉀吸收效率具有重要意義。本研究對陸地棉鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn), pGhHAK5除了含有基礎(chǔ)元件外, 還含有多個(gè)參與光、植物激素、逆境脅迫和生物鐘等順式作用元件(表1和圖2), 這些元件的存在, 暗示著基因的表達(dá)可能受多種外界條件的影響。先前研究表明, 陸地棉基因的表達(dá)受低鉀脅迫誘導(dǎo)[18], 但其他逆境脅迫或者養(yǎng)分脅迫是否也能引起基因表達(dá)的變化目前還不清楚。在擬南芥中,的表達(dá)除受低鉀誘導(dǎo)外, 還受其他的一些逆境條件如低鈣、鹽脅迫和ABA脅迫等不同程度影響[33]。另外, 氮(NO3-)和磷(P)也可誘導(dǎo)擬南芥和番茄基因表達(dá)水平的升高[34]。因此, 在今后的研究中, 有必要在多種逆境脅迫或養(yǎng)分脅迫條件下來進(jìn)一步研究的表達(dá)特性。

圖6 轉(zhuǎn)pGhHAK5擬南芥幼苗對低鉀脅迫的響應(yīng)

WT: 野生型擬南芥; HK: 正常鉀; LK: 低鉀。a: 擬南芥幼苗; b: 葉對應(yīng)位置放大圖; c: 根對應(yīng)位置放大圖。

WT: wild typeseedlings; HK: high potassium; LK: low potassium. a:seedlings; b: enlarged view of leaf; c: enlarged view of roots.

圖7 陸地棉GhHAK5基因的時(shí)空表達(dá)特性分析

A: 陸地棉基因時(shí)空表達(dá)特性的轉(zhuǎn)錄組分析; B: 陸地棉基因時(shí)空表達(dá)特性的熒光定量PCR分析; C: 不同發(fā)育時(shí)期棉花根系形態(tài)的比較; **表示在0.01水平上差異顯著。

A: transcriptome analysis of spatio-temporal expression ofin upland cotton; B: quantitative real-time PCR analysis of spatio-temporal expression ofin upland cotton; C: the comparison of roots morphological change at different development stages in cotton; ** Significant at the 0.01 probability level.

在許多植物中, 鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的表達(dá)具有組織特異性, 其主要在根中表達(dá)[12,27,30,32]。本研究對pGhHAK5序列分析發(fā)現(xiàn), pGhHAK5與同源基因的啟動(dòng)子一樣, 具有參與根特異性表達(dá)的調(diào)控元件(ATAAAAT)(圖3), 暗示著可能是一個(gè)在根中特異性高表達(dá)的基因。但是, 本研究對轉(zhuǎn)pGhHAK5擬南芥植株的GUS組織定位分析發(fā)現(xiàn), pGhHAK5驅(qū)動(dòng)的主要在擬南芥成熟的根、葉脈、花萼維管束和胚軸維管束組織中表達(dá)(圖5), 表明本研究克隆的pGhHAK5片段在擬南芥中不能驅(qū)動(dòng)根特異性的表達(dá)調(diào)控模式, 盡管先前研究表明是一個(gè)在根中特異性高表達(dá)的基因[18]。同樣地,也是一個(gè)在根中特異性高表達(dá)的基因, 然而將1.5 kb的啟動(dòng)子片段連上并進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化后發(fā)現(xiàn), pEgHKK5驅(qū)動(dòng)的除在煙草根中高表達(dá)外, 在葉脈和胚軸的維管束組織中也大量地表達(dá)[27]。在擬南芥中,基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的僅在擬南芥的根中表達(dá), 本研究觀察到的pGhHAK5驅(qū)動(dòng)的非特異性組織表達(dá)模式, 可能是由于本研究克隆的啟動(dòng)子片段缺乏一些其他的重要組織特異性調(diào)控元件, 也或者是由于pGhHAK5可能需要與棉花中特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合才能激活其組織特異性的表達(dá)調(diào)控模式。因此, 在今后的研究中, 有必要將pGhHAK5通過轉(zhuǎn)化棉花植株來進(jìn)一步研究其功能。

鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控被認(rèn)為是植物響應(yīng)外界低鉀脅迫的一項(xiàng)重要機(jī)制[35-37]。在擬南芥中, 鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因是維持植物在低鉀條件下高效吸收環(huán)境中鉀離子的重要基因, 其表達(dá)調(diào)控除受和兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子影響外, 可能還有其他多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控[38]。轉(zhuǎn)錄因子作為低鉀條件下調(diào)控?cái)M南芥表達(dá)的重要參與者, 該基因缺失的突變體與過表達(dá)植株具有相同的表型, 它們的高親和性鉀吸收能力均顯著提升[14]。本研究克隆的陸地棉啟動(dòng)子具有1個(gè)在低鉀條件下參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TGTCNN), 說明轉(zhuǎn)錄因子可能參與陸地棉的表達(dá)調(diào)控, 但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。GCC-box位點(diǎn)是擬南芥啟動(dòng)子序列中可與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的重要基序[39], 但是陸地棉啟動(dòng)子序列中不含有GCC-box位點(diǎn), 表明陸地棉可能具有與擬南芥不一樣的表達(dá)調(diào)控機(jī)制?？偟膩碚f, 基因的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過程, 一方面單個(gè)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)可能受多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控, 另外多個(gè)激酶參與的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在植物響應(yīng)鉀缺乏和增強(qiáng)鉀吸收方面也起著重要作用[40]。因此, 在以后的研究中, 如何將反向遺傳學(xué), 如表達(dá)數(shù)量性狀定位方法(eQTL)[41]與正向遺傳學(xué)的方法相結(jié)合來鑒定調(diào)控表達(dá)的關(guān)鍵因子, 對于我們深入認(rèn)識(shí)陸地棉響應(yīng)低鉀脅迫的分子機(jī)理和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要。

4 結(jié)論

從陸地棉品種百棉1號(hào)中克隆了鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因上游2000 bp的啟動(dòng)子片段pGhHAK5, 并構(gòu)建融合表達(dá)載體pGhHAK5::GUS。通過轉(zhuǎn)化擬南芥表明pGhHAK5能在擬南芥中驅(qū)動(dòng)的表達(dá), 且其驅(qū)動(dòng)的主要在擬南芥成熟的根和地上部維管束組織中表達(dá), 在幼嫩的根中表達(dá)很弱且不受低鉀脅迫誘導(dǎo), 表明本研究克隆的pGhHAK5可能是一個(gè)主要在成熟根中具有功能的低鉀誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

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Cloning and functional analysis of promoter of potassium transporter genein upland cotton (L.)

CHAO Mao-Ni1, HU Hai-Yan1,*, WANG Run-Hao1, CHEN Yu2, FU Li-Na1, LIU Qing-Qing1, WANG Qing-Lian1

1Henan Institute of Science and Technology / Henan Collaborative Innovation Center of Modern Biological Breeding, Xinxiang 453003, Henan, China;2Cotton Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, Shandong, China

Transcriptional regulation of KUP/HAK/KT potassium transporter gene is an important mechanism of plant response to low potassium stress. Cloning and analysis of promoter of potassium transporter gene in cotton is not only helpful to understand its expression pattern and regulation mechanism, but also important to improve the potassium absorption in cotton. Potassium transporter geneis a highly expressed in roots and induced by low potassium stress in upland cotton, but the function of its promoter is still unclear. In this study, the 2000 bp promoter fragment ofwas cloned from upland cotton variety Baimian 1 by using PCR amplification, and its function was analyzed by GUS histochemical staining and induced expression analysis ofunder low potassium in pGhHAK5 transgenic. In addition to TATA-box, CAAT-box and other basic-acting elements, pGhHAK5 also contained a number of-acting elements responsive to light, stress, phytohormone and circadian. pGhHAK5 was highly consistent with pGrHAK5 in the number and location of important regulatory elements, and had five root-specific expression regulatory elements (ATAAAAT) and an ARF transcription factor binding site (TGTCNN) involved in transcription regulation under low potassium conditions. GUS histochemical staining of transgenicseedlings showed that the leaf veins and vascular tissue of hypocotyl were deeply stained, and the roots were shallowly stained. For matureplants, enhanced GUS staining was observed in roots, leaf veins and the vascular tissue of calyx, and weakened GUS staining was observed in stem and pod skin, suggesting that pGhHAK5-drivenwas mainly expressed in mature roots and vascular tissue of shoots. Induced expression analysis ofunder low potassium in pGhHAK5 transgenicshowed that the expression ofdriven by pGhHAK5 was weak in young roots ofseedlings, and its expression was not enhanced by low potassium stress. These results suggest that pGhHAK5 might be a potassium-deficient inducible promoter mainly in mature roots. Transcriptome and quantitative real-time PCR analysis showed thatexpression in roots was affected by developmental stages, which was consistent with the results ofexpression driven by pGhHAK5 in. These results are helpful to understand the molecular mechanism ofexpression regulation, and provide theoretical basis for improving potassium uptake efficiency and breeding potassium efficient varieties in cotton.

promoter; vascular tissues; potassium transporter; low potassium; upland cotton

2019-04-25;

2019-08-09;

2019-09-12.

10.3724/SP.J.1006.2020.93027

胡海燕, E-mail: haiyanhuhhy@126.com, Te1: 0373-3040337

chaomaoni@126.com

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31601347)，河南省博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(1902042)，河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(192102110030)和河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研計(jì)劃項(xiàng)目(19A210013)資助。

This study was supported by theNational Natural Science Foundation of China (31601347), the Henan Postdoctoral Science Foundation (1902042), the Henan Scientific and Technological Research Program (192102110030), and the Key Research Projects of Henan Higher Education Institutions (19A210013).

URL: :http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190912.1507.002.html