柯丹霞 彭昆鵬

利用酵母雙雜交系統篩選大豆結瘤因子受體NFR1α的互作蛋白

柯丹霞*彭昆鵬

信陽師范學院生命科學學院 / 大別山農業(yè)生物資源保護與利用研究院, 河南信陽 464000

大豆是重要的植物蛋白作物和糧豆間作作物, 挖掘大豆的生物固氮潛力, 對推動生態(tài)農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有深遠意義。大豆結瘤因子受體蛋白GmNFR1a(Nod Factor Receptor)對結瘤至關重要, 但其具體調控機制尚不明確。本研究以大豆mRNA為模板, 利用RT-PCR方法擴增到GmNFR1a蛋白的激酶結構域(GmNFR1a-pk), 構建了pGBKT7-GmNFR1a-pk誘餌表達載體, 通過酵母雙雜交技術, 篩選大豆根瘤AD-cDNA文庫, 從文庫中分離到與GmNFR1a-pk相互作用的71個陽性克隆, 經測序和同源性分析篩選到12種與GmNFR1a-pk互作的蛋白, 包括鈣離子結合手性蛋白、豆血紅蛋白、結瘤素Nod44等蛋白。以大豆豆血紅蛋白GmLbc2為例, 回轉酵母以及煙草體內BiFC驗證其與誘餌蛋白的相互作用, 對其進行同源蛋白比對及系統進化樹分析, 并利用百脈根毛根轉化技術鑒定GmLbc2在結瘤過程中的生物學功能。研究結果進一步補充和完善了GmNFR1a介導的結瘤信號傳遞途徑, 為大豆與根瘤菌共生互作機制提供了新的分子證據。

大豆; 共生固氮; 結瘤因子受體蛋白; 酵母雙雜交; 豆血紅蛋白

豆科植物與根瘤菌互惠共生, 在形成的特殊器官根瘤中, 大氣中分子態(tài)的氮被轉變?yōu)榭杀恢参镏苯永玫陌?。類黃酮化合物作為豆科植物分泌的信號分子, 誘導根瘤菌產生結瘤因子(nod factor, NF)。NF作為根瘤菌信號分子反過來作用于豆科植物, 啟動一系列結瘤反應[1-3]。在模式豆科植物百脈根和苜蓿中, 結瘤因子受體蛋白分別為LjNFR1和LjNFR5[4-5]、MtLYK3/MtLYK4和MtNFP[6-8]。它們屬于LysM類受體激酶(LysM-RLKs), 由膜內的絲/蘇氨酸蛋白激酶結構域、中部跨膜結構域和膜外2~3個LysM結構域共同組成。百脈根LjNFR1和苜蓿MtLYK3均具有蛋白激酶活性, 而LjNFR5和MtNFP因為缺少激活環(huán)而不具備激酶活性。研究表明, 百脈根的2個結瘤因子受體蛋白可以形成異源二聚體[9], 高親和性地直接結合NF[10-11], 并且LjNFR1能夠體外磷酸化LjNFR5[9], 這些證據表明結瘤因子受體蛋白可能以異源二聚體的形式與NF結合, 共同參與接收NF信號, 隨后通過激酶間的磷酸化作用將NF信號傳遞下去。

近年的研究發(fā)現, 結瘤因子受體蛋白接收并傳遞NF信號的過程還需要其他蛋白共同參與。在苜蓿中篩選到1個MtLYK3的互作蛋白-E3泛素連接酶MtPUB1。MtLYK3的激酶結構域能夠磷酸化MtPUB1, MtPUB1在結瘤過程的早期侵染階段發(fā)揮作用[12]。在百脈根中也發(fā)現1個E3泛素連接酶LjPUB13能夠專一地泛素化LjNFR5的激酶結構域, 從而正調控百脈根根瘤器官的發(fā)生[13]。此外, 苜蓿中的MtSYMREM1能夠分別與MtLYK3和MtNFP互作, MtSYMREM1屬于Remorin蛋白, 是一類植物特有的蛋白家族。MtSYMREM1在質膜通過調控結瘤因子受體蛋白參與早期侵染過程, 影響侵染線的極性生長以及根瘤菌的釋放[14]。同源克隆百脈根LjSYMREM1發(fā)現, 它能夠在體內與結瘤因子受體蛋白發(fā)生瞬時互作, 在體外能夠被LjNFR1磷酸化, 參與調控根瘤菌侵染過程[15]?？碌は嫉萚16-17]前期利用酵母雙雜交技術, 在百脈根中篩選到LjNFR5的互作蛋白LjROP6, 并證實LjROP6正調控根瘤菌對豆科植物的侵染。最近張忠明研究團隊又報道了1個新的LjNFR5相互作用蛋白-百脈根二氫黃酮醇還原酶LjDFL1, 并證實苜蓿中的同源蛋白MtNFP和MtDFL1之間也能夠發(fā)生相互作用, 推測這2種蛋白之間的互作在不同豆科植物中保守存在[18]。以上證據表明, NFRs及其介導的結瘤信號轉導途徑在模式豆科植物百脈根和苜蓿中得到了較為廣泛和深入的研究, 而大豆中關于這方面的研究報道較少。

大豆()是一種重要的蛋白質和油料作物。充分發(fā)揮大豆的根瘤共生固氮作用, 對提高產量, 改良品質意義重大。大豆中已經鑒定到4個結瘤因子受體蛋白, 即GmNFR1α/β和GmNFR5α/ β[19]。GmNFR1α和GmNFR1β分別位于大豆第2號、14號染色體上, 二者之間有著相似的外顯子-內含子結構, 堿基和氨基酸序列同源性分別為92%和89%。GmNFR1α和GmNFR1β在DNA序列和外顯子-內含子結構上與LjNFR1高度相似, 與LjNFR1和MtLYK3的氨基酸序列相似性分別為79%和75%。生物學功能研究表明, 超表達GmNFR1α能夠增加每株大豆的結瘤數, 而GmNFR1β的突變體對結瘤沒有影響, GmNFR1β在根瘤菌滴度較低情況下不能感知NF, 但是可以誘導皮層細胞分裂。GmNFR5α/β的突變體不能引起結瘤過程的任何形態(tài)學變化。GmNFR1β單獨與GmNFR5α/β結合, 在表皮和根毛細胞中不能有效識別NF, 根毛變形、卷曲以及侵染線的形成也被抑制。相反, GmNFR1α與GmNFR5α/β結合能夠實現完整的有效結瘤過程[19]。以上結果說明, GmNFR1β的功能是冗余的, GmNFR1α與LjNFR1功能相似, 對結瘤至關重要。但是目前關于GmNFR1α 在共生互作中的具體功能和信號傳遞機制尚不清楚, 因此, 篩選GmNFR1α相互作用蛋白, 闡明互作蛋白之間結瘤信號的傳遞方式, 對于揭示GmNFR1α在結瘤信號轉導途徑中的調控機制具有重要意義。

本研究以大豆結瘤因子受體蛋白GmNFR1α為誘餌, 利用酵母雙雜交技術, 篩選大豆根瘤AD-cDNA文庫, 釣取GmNFR1α的互作蛋白, 通過互作蛋白的生物信息學分析及其在共生結瘤信號途徑中的生物學功能鑒定, 補充和完善GmNFR1α介導的結瘤信號傳遞途徑的認知, 為大豆與根瘤菌共生互作機制提供新的分子證據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆根瘤cDNA文庫、酵母菌株Y2Hgold、Y187由中國農業(yè)科學院油料作物研究所大豆研究室提供; 大豆品種Willimas 82由中國科學院東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所孔凡江研究員提供; 酵母質粒抽提試劑盒、ABA、X-α-Gal等購自Clontech公司; pMD18-T載體、T4DNA連接酶、限制性內切酶、RNA提取及RT-PCR試劑盒等購自TaKaRa公司; 常規(guī)的克隆載體、大腸桿菌菌株等均為本實驗室保存。

1.2 植物材料處理

在通風廚中令大豆種子在生成的Cl2中消毒過夜[20]。將無菌種子種臍朝下均勻平鋪于無菌水潤濕的濾紙上, 以封口膜密封培養(yǎng)皿, 22°C暗培養(yǎng)。大豆幼苗根長2~3 cm時收集根部組織, 液氮速凍后保存于-80°C冰箱。

1.3 誘餌質粒的構建

根據NCBI網站公布的序列(GenBank登錄號為DQ219805)設計NFR1α-pk (943~ 1755位堿基)引物。F-NFR1α-pk為5′-GAGCTTGGAGAATAAAATTGG-3′ (下畫線部分為R I酶切位點), R-NFR1α-pk為5′-GCAAGTGTCATGAGAGCAAC-3′ (下畫線部分為I酶切位點)。提取大豆根部組織總RNA, 按照TaKaRa公司RT-PCR試劑盒說明書進行反轉錄, 擴增出片段, 其長度為813 bp。將測序正確的目的片段經RI/I雙酶切后連接到pGBKT7上。酶切、測序檢測無誤后即獲得誘餌質粒pGBKT7- GmNFR1α-pk。

1.4 誘餌質粒自激活及毒性檢測

采用LiAc法制備酵母菌株Y2HGold 的感受態(tài)細胞, 將測序正確的誘餌質粒與pGADT7空載體共轉化Y2HGold, 以含有pGBKT7-53和pGADT7-T質粒的酵母菌為陽性對照, 以含有pGBKT7-lam和pGADT7-T 質粒的酵母菌為陰性對照。將轉化后的菌液涂布于DDO/X (SD/–Leu/–Trp/X-a-Gal)平板, 置30°C培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)3~5 d, 觀察菌落的顯色情況, 確定誘餌蛋白是否具有自激活活性。分別挑取SD/–Trp平皿上直徑為2~3 mm的誘餌質粒和對照空載體pGBKT7單菌落接種于SD/–Trp/Kan (50 μg mL-1)的液體培養(yǎng)基中, 30°C搖床培養(yǎng)24 h, 測定OD600值以判定誘餌蛋白是否對酵母菌株產生毒性。

1.5 篩選大豆根瘤AD-cDNA文庫

參照Clontech公司Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual所述方法, 接種新鮮的2~3 mm誘餌菌落到SD/–Trp液體培養(yǎng)基中, 30°C搖床培養(yǎng)過夜至OD600達到0.8。離心, 棄上清液, 用4~5 mL SD/–Trp液體重懸沉淀。室溫融化1 mL文庫菌株, 將文庫菌株與誘餌菌株加入含有45 mL 2×YPDA/Kan (50 μg mL-1)液體培養(yǎng)基的2 L錐形瓶中, 30°C搖床低速振蕩培養(yǎng), 以防止細胞在錐形瓶中沉淀(劇烈搖動會降低交配效率, 但晃動過慢會使細胞沉淀, 也降低交配效率)。將雜交20~24 h后的混合液涂布在DDO/X/A (SD/–Leu/–Trp/X-a- Gal/AbA)選擇培養(yǎng)基上, 30°C培養(yǎng)4~6 d, 挑取直徑大于2 mm的藍色菌落點種于QDO/X/A (SD/–Ade/– His/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA)選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)3~5 d, 觀察并統計酵母的生長及顯藍情況。

1.6 文庫陽性克隆的鑒定

挑取QDO/X/A平板上生長良好且顯藍的菌落, 參考Easy Yeast Plasmid Isolation Kit說明書提取質粒。pGADT7載體通用引物(F-AD: 5′-CTATTCGA TGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3′; R-AD: 5′- GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′)進行菌落PCR, 根據擴增的PCR片段大小分析pGADT7載體中插入的DNA片段長度, 并排除大小一致的重復克隆, 初步確定陽性克隆子。

1.7 陽性克隆的測序及酵母回轉驗證

將上述陽性克隆子轉化大腸桿菌DH5α, 涂布于LB/Amp (100 μg mL-1)培養(yǎng)基上用于分離文庫質粒。抽提文庫質粒, 送交公司測序。根據測序結果將獲得的文庫質粒逐一與pGBKT7-GmNFR1α-pk誘餌質粒共轉化至Y2HGold酵母菌株中, 并在QDO/X/A選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選, 回轉酵母后再次顯藍的文庫質粒可以保種用于今后的研究。

1.8 煙草體內BiFC實驗

根據NCBI網站公布的和序列分別構建BiFC載體; 將測序正確的pSCYNE- NFR1α和pSCYCE(R)-GmLbc2熒光互補載體分別轉化農桿菌GV3101, 倒置, 28°C培養(yǎng)2~3 d; 挑取單菌落于5 mL LBK液體培養(yǎng)基中, 28°C, 振蕩培養(yǎng)1~2 d, 待OD600達到0.6左右, 離心收集菌體, 用農桿菌轉化緩沖液分別將農桿菌的OD600調至0.5, 等體積混合兩個熒光互補載體的農桿菌懸浮液。室溫放置1 h活化農桿菌; 去掉1 mL注射器的針頭, 吸取農桿菌混合液, 注射至煙草葉片的下表皮; 將轉化后的煙草黑暗培養(yǎng)1~2 d; 然后制片, 用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號并照相。

1.9 陽性克隆的生物信息學分析

根據測序結果分析文庫載體中插入的DNA序列, 利用NCBI網站的Blast功能預測目的基因開放讀碼框長度以及編碼蛋白的二級、三級結構特征, 用DNAMAN軟件進行序列同源性比對分析, 利用MEGA 4.0構建系統進化樹。

1.10 轉GmLbc2基因超表達復合體植株的共生表型鑒定

將上述擴增的基因全長序列連入植物表達載體pU1301中, 構建超表達載體pU 1301- GmLbc2, 并轉入發(fā)根農桿菌LBA1334菌株中。利用百脈根()毛根轉化方法獲得轉基因的超表達復合體植株。百脈根MG20種子經表面滅菌、萌發(fā)后, 剪去下胚軸, 將幼苗子葉部分放入攜帶重組質粒的農桿菌菌懸液中侵染30 min, 隨后轉移到MS平板上暗培養(yǎng)5 d, 再移至含250 mg L-1羧卞的MS培養(yǎng)基上, 直至毛根長出。取毛根根尖處1 cm根段, 用GUS染液鑒定轉基因陽性毛根, 然后提取陽性毛根總RNA, 以RT-PCR檢測基因的表達, 百脈根多聚泛素(polyubiquitin)基因作為內參, 空載體(pU1301)陽性毛根作為陰性對照。將RT-PCR檢測為陽性的復合體百脈根移入無菌沙盆中煉苗5 d, 接種根瘤菌MAFF303099, 每天澆灌無菌Fahraeus無氮營養(yǎng)液。接種30 d后, 對結瘤表型進行統計并拍照, 根據單株結瘤數和樣本量(= 20), 計算單株(CK和GmLbc2-OX)平均結瘤數, 試驗重復3次, 采用Microsoft Excel 2007中的檢驗分析數據, 并繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 誘餌質粒的構建和自激活及毒性檢測

經PCR擴增得到的膜內激酶結構域, 大小為813 bp, 與預期長度一致。通過R I/I雙酶切, 將構建至誘餌載體pGBKT7上。重組質粒經雙酶切可獲得7300 bp的載體片段和813 bp 的插入片段(圖1-A)。測序結果表明, 插入片段與NCBI數據庫中公布的基因序列完全一致。說明已成功克隆了基因并構建了酵母誘餌質粒pGBKT7-GmNFR1α-pk。

共轉化誘餌質粒pGBKT7-GmNFR1α-pk與pGADT7空載體, 以含有pGBKT7-53和pGADT7-T質粒的酵母菌為陽性對照, 以含有pGBKT7-lam和pGADT7-T質粒的酵母菌為陰性對照。結果顯示只有陽性對照在DDO/X平板上出現藍色菌落, 誘餌質粒和pGADT7空載體組合與陰性對照一樣, 只出現白色菌落(圖1-B~D), 說明表達的GmNFR1α-pk誘餌蛋白不具有自激活活性。含有誘餌質粒和對照空載體的2種酵母菌在相同條件下培養(yǎng)24 h后生長情況相似, OD600值均大于0.8, 說明誘餌蛋白長勢良好, 對酵母菌株無毒性, 可以直接用于后續(xù)酵母雙雜交文庫的篩選。

圖1 誘餌質粒pGBKT7-GmNFR1α-pk的構建及自激活檢測

(A) M: trans 2K Plus II DNA marker; 1: GmNFR1α-pk目的片段擴增; 2: pGBKT7-GmNFR1α-pk誘餌質粒雙酶切; 3: pGBKT7空載體雙酶切。(B)陽性對照(pGBKT7-53和pGADT7-T)。(C)陰性對照(pGBKT7-lam和pGADT7-T)。(D) pGBKT7-GmNFR1α-pk與pGADT7空載體。

(A) M: trans 2K Plus II DNA marker; 1: isolation of GmNFR1α-pk cDNA; 2: pGBKT7-GmNFR1α-pk digested byRI andI; 3: pGBKT7 digested byRI andI. (B) positive control (pGBKT7-53 and pGADT7-T). (C) negative control (pGBKT7-lam and pGADT7-T). (D) pGBKT7-GmNFR1α-pk and pGADT7.

2.2 篩選與GmNFR1α-pk互作的蛋白

以pGBKT7-GmNFR1α-pk為誘餌篩選大豆根瘤cDNA文庫, 將含有誘餌質粒的酵母菌株Y2HGold與含有文庫的酵母菌株Y187進行有性雜交, 將雜交后的混合液涂布于DDO/X/A平板上, 30°C培養(yǎng)4~6 d, 挑取直徑大于2 mm的藍色菌落點種于QDO/X/A平板上培養(yǎng)3~5 d, 統計菌落生長及顯藍情況。結果共有71個生長狀況良好且顯藍的菌落, 部分結果見圖2-A。

挑取QDO/X/A平板上的陽性菌落, 擴繁并提取酵母質粒, 以PCR鑒定cDNA文庫插入片段的大小, 舍棄500 bp 以下的小片段(圖2-B)。將剩余的陽性酵母質粒轉化大腸桿菌DH5, 菌液送交公司進行核苷酸序列測定, 測序結果與GenBank數據庫進行同源性比較, 將載體的閱讀框與目的基因不同的克隆排除掉, 最終篩選到12種與GmNFR1α-pk互作的蛋白, 包括鈣離子結合手性蛋白、豆血紅蛋白、結瘤素Nod44、肌醇-磷酸合酶、甲酰轉移酶、氨基酸轉移酶、NAD激酶、分子伴侶樣蛋白HYPK、抗增殖蛋白prohibitin-2等。

圖2 酵母雙雜交 cDNA 文庫的篩選

(A) QDO/X/A平板上的陽性克隆; (B) PCR 檢測酵母雙雜交cDNA文庫插入片段大小。

(A) positive clones on QDO/X/A plate; (B) PCR detection of inserts from yeast two-hybrid cDNA library.

2.3 蛋白相互作用的驗證

為進一步驗證GmNFR1α-pk與靶蛋白的相互作用, 本研究以篩選到的其中一個互作蛋白-大豆血紅蛋白GmLbc2 (Leghemoglobin C2)為例, 分別將GmLbc2/GmNFR1α-pk、陰性對照及陽性對照質粒轉入酵母菌株Y2HGold, 涂在QDO/X/A培養(yǎng)基上, 30°C培養(yǎng)3~5 d。觀察發(fā)現, GmNFR1α-pk與靶蛋白GmLbc2共轉化時, 在QDO/X/A培養(yǎng)基上菌落呈藍色(圖3-A), 表明二者在酵母體內能夠發(fā)生相互作用,酵母回轉實驗進一步驗證了陽性克隆的正確性, 排除了假陽性的干擾。將和基因分別構建到BiFC中配對的2個載體上, 然后通過瞬時表達系統共轉化煙草, 在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光發(fā)生情況, 證實2個蛋白在煙草體內也存在相互作用, 且互作的位置在煙草表皮細胞的細胞膜(圖3-B)。

2.4 GmLbc2蛋白的生物信息學分析

已有研究表明, 大豆血紅蛋白GmLb受根瘤菌誘導表達, 是存在于共生根瘤類菌體內的一種組織特異性蛋白。GmLb的含量和根瘤的固氮酶活性呈正相關性, 根瘤中GmLb未表達前, 根瘤是沒有固氮能力的; 隨著GmLb含量的增加, 固氮能力增強; 衰老的根瘤伴隨著GmLb的消失, 固氮作用也喪失。GmLb由4個主要組分Lbc1、Lbc2、Lbc3、Lba構成。本研究中篩選到的GmNFR1α-pk互作蛋白即為其中的Lbc2蛋白。序列分析表明, 全長的大豆基因大小為438 bp, 編碼蛋白包含145個氨基酸殘基。預測的分子量大小為15.5 kD, 理論等電點為5.38。經過Blastp以及DNAMAN軟件分析, 對大豆基因編碼的氨基酸序列進行同源比對發(fā)現, GmLbc2與GmLbc3、野生大豆GsLbc1和GmLba同源性較高(圖4)。同時, GmLbc2蛋白與上述不同豆科植物的豆血紅蛋白的進化樹分析表明, GmLbc2與GmLbc3處在同一進化分支上, 親緣關系最近(圖5)。

2.5 過表達GmLbc2基因對百脈根陽性毛根共生結瘤的影響

為了鑒定基因在結瘤過程中的生物學功能, 根據基因序列信息, 構建超表達載體pU1301-通過毛根轉化法導入模式豆科植物百脈根毛根中, 進行盆栽實驗。接種根瘤菌30 d后,基因在百脈根毛根中的過量表達可以顯著增加結瘤數目(圖6-A~C)。qRT-PCR結果顯示, 在超表達植株中基因的表達水平為對照的12倍, 說明百脈根復合體植株結瘤數目的增加是由于GmLbc2基因的過量表達引起的。以qRT-PCR進一步分析結瘤標志基因NIN、ENOD40-1和ENOD40-2在復合體植株毛根中的表達水平表明, GmLbc2基因的過量表達顯著增加這3種結瘤標志基因的表達水平(圖6-D)。

圖3 GmNFR1α與GmLbc2相互作用的驗證

(A)酵母雙雜交系統驗證GmNFR1α-pk與GmLbc2的相互作用。1: 陽性對照(pGBKT7-53和pGADT7-T); 2: 陰性對照(pGBKT7-lam和pGADT7-T); 3: pGBKT7-GmNFR1α-pk與pGADT7-GmLbc2。(B)雙分子熒光互補技術驗證GmNFR1α全長與GmLbc2的相互作用。

(A) yeast two-hybrid analysis of interaction between GmNFR1α-pk and GmLbc2. 1: positive control (pGBKT7-53 and pGADT7-T); 2: negative control (pGBKT7-lam and pGADT7-T); 3: pGBKT7-GmNFR1α-pk and pGADT7-GmLbc2. (B) BiFC analysis of interaction between GmNFR1α and GmLbc2.

3 討論

大豆在農業(yè)生產中發(fā)揮著舉足輕重的作用, 大豆與谷物作物玉米、小麥等間作可促進氮的轉移, 減少施肥量的同時增加谷物作物的產量, 并改善土壤氮營養(yǎng)狀況, 對大豆共生信號調控網絡的研究具有重要的現實意義。前人研究表明, 過量表達大豆結瘤因子受體激酶GmNFR1α可以使結瘤增加, 并增強大豆植株在酸性土壤中形成根瘤的能力。GmNFR1α能夠直接參與調控大豆G蛋白信號通路。G蛋白亞基Gα與G蛋白活性調節(jié)因子RGS都能夠直接與GmNFR1α發(fā)生相互作用, GmNFR1α通過磷酸化RGS, 調控Gα蛋白活性, 從而維持根瘤的正常發(fā)育[21-22]。目前關于GmNFR1α在共生結瘤固氮中的信號傳遞機制研究才剛剛起步, 其介導的下游信號傳遞途徑仍有待進一步補充和完善。因此, 篩選新的GmNFR1α相互作用蛋白, 闡明互作蛋白之間結瘤信號的傳遞方式, 對于揭示GmNFR1α在結瘤信號轉導途徑中的調控機制具有重要意義, 該工作具有原創(chuàng)性。酵母雙雜交技術可以在活體內驗證蛋白之間的相互作用, 是一種高效發(fā)掘新基因、探索基因調控網絡的方法[23]。本研究成功地利用該系統篩選到GmNFR1α的相互作用蛋白, 并對這些靶蛋白進行了進化及功能分析, 為揭示GmNFR1α在結瘤因子信號傳遞過程中的調控機制提供了新證據。

利用BLAST數據庫對得到的靶蛋白進行結構功能域和同源性分析, 篩選到12種與GmNFR1α-pk互作的蛋白, 包括鈣離子結合手性蛋白、豆血紅蛋白、結瘤素Nod44、肌醇-磷酸合酶、甲酰轉移酶、氨基酸轉移酶、NAD 激酶、分子伴侶樣蛋白HYPK、抗增殖蛋白prohibitin-2等。其中, 重復克隆數最多的蛋白為大豆血紅蛋白GmLbc2。大豆血紅蛋白與固氮作用密切相關, 通過調節(jié)根瘤中游離O2的濃度, 保護類菌體產生的易受O2破壞的固氮酶[24]。根瘤中大豆血紅蛋白的含量與固氮酶活性呈正相關性, 根瘤菌侵染大豆根系誘導大豆血紅蛋白表達后, 根瘤才能夠正常地進行固氮作用, 才能為宿主植物提供生長所需的氮源[25]。在大豆結瘤信號途徑中，本研究首次將結瘤因子受體蛋白與豆血紅蛋白聯系起來, 證實二者在酵母體內的互作。推測GmNFR1α-pk與GmLbc2互作可能將早期結瘤因子信號感知和后期有效根瘤的形成有機整合起來, 但具體作用方式及機制還需進一步研究。下一步我們將通過細胞生化實驗進一步研究這些靶蛋白與GmNFR1α的互作機制和互作功能區(qū)域, 通過靶標基因的超表達和敲除實驗研究這些靶蛋白的生物學功能, 期待破解大豆結瘤因子受體蛋白GmNFR1α在共生信號轉導途徑中的具體功能及分子調控機制。

圖4 大豆GmLbc2與其他植物同源蛋白的序列比對分析

Gm: 栽培大豆,; Gs: 野生大豆,; Cc: 木豆,; Va: 赤豆,; Vr: 綠豆,; Mt: 蒺藜苜蓿,; Lj: 百脈根,; As: 紫云英,。

Gm:; Gs:; Cc:; Va:; Vr:; Mt:; Lj:; As:.

圖5 大豆GmLbc2蛋白與同系物的系統進化分析

標尺代表遺傳相似性, 表明不同物種間同系物進化關系的遠近?？s寫同圖4。

The scale represents genetic similarity, indicating the proximity relationships among species. Abbreviations are the same as those given in Fig. 4.

綜上所述, 本研究從大豆根瘤AD-cDNA文庫中獲得多個與GmNFR1α相互作用的靶蛋白, 并以大豆血紅蛋白GmLbc2為例, 對其進行同源蛋白比對及系統進化樹分析, 推測二者互作共同調控結瘤過程, 研究結果為進一步闡明GmNFR1α的信號傳遞機制提供了理論依據?？梢韵嘈? 對GmNFR1α互作蛋白功能及作用機制的深入研究必將大大推動大豆共生信號調控網絡的研究, 也將為實現非豆科植物的共生固氮提供重要的科學線索。

4 結論

利用酵母雙雜交篩選大豆根瘤中GmNFR1α- pk的相互作用蛋白, 獲得12種靶蛋白。以大豆豆血紅蛋白GmLbc2為例, 對其進行同源蛋白比對、系統進化樹及生物學功能分析, 為進一步闡明GmNFR1α的信號傳遞機制提供了理論依據。

圖6 過表達GmLbc2對百脈根陽性毛根共生結瘤的影響

(A)空載體對照復合體植株的結瘤表型。(B)超表達(GmLbc2-OX)復合體植株的結瘤表型; 接種根瘤菌30 d 后照相, Bars = 5 mm。(C)平均每個植株的結瘤數目, **表示<0.01。(D) qRT-PCR檢測、、和的表達水平。

(A) phenotype of hairy roots expressing p1301U (CK). (B) phenotype of hairy roots overexpressing(GmLbc2-OX); photographs were taken at 30 d after inoculation, Bars = 5 mm. (C) mean number of nodules per plant with standard deviation (SD) ofexpressing empty vector pU1301 (CK) of GmLbc2-OX at 30 days after inoculation with, **<0.01. (D) transcript levels of,,, andin CK and GmLbc2-OX hairy roots detected by qRT-PCR.

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Screening of NFR1α-interactive proteins in soybean using yeast two hybrid system

KE Dan-Xia*and PENG Kun-Peng

College of Life Sciences, Xinyang Normal University / Institute for Conservation and Utilization of Agro-bioresources in Dabie Mountains, Xinyang 464000, Henan, China

Soybean is the important plant protein crop and grain-bean intercropping crop. Exploring the biological nitrogen fixation potential of soybean is of far-reaching significance to promote the sustainable development of ecological agriculture. GmNFR1α, a soybean nod factor receptor protein, is very important for nodulation, but its specific regulatory mechanism is still unclear. Soybean mRNA was used as template to amplify the kinase domain of GmNFR1α protein (GmNFR1α-pk) by RT-PCR method and the pGBKT7-GmNFR1α-pk bait plasmid was constructed. Seventy-two positive clones interacted with GmNFR1α-pk were isolated through yeast two hybrid screening of soybean nodule AD-cDNA library from the library. Among them, 12 proteins including calcium ion binding chiral protein, hemoglobin, nodulin Nod44 and other proteins interacted with GmNFR1α-pk were screened by sequencing and homology analysis. The interaction between soybean hemoglobin and bait protein was verified by re-transforming in yeast and BiFC in tobacco. Comparison of homologous proteins and phylogenetic tree analysis were also done at the same time. The important function of GmLbc2 in nodulation process was clarified by hairy root transformation technology in. The results further complement and improve the signal transduction pathway mediated by GmNFR1α, and provide new molecular evidence for the symbiotic interaction mechanism between soybean and rhizobia.

soybean; symbiotic nitrogen fixation; nod factor receptor protein; yeast two-hybrid; soybean hemoglobin

2019-03-07;

2019-08-09;

2019-09-02.

10.3724/SP.J.1006.2020.94036

柯丹霞, E-mail: kdx_029@163.com

研究由國家自然科學基金項目(31400213), 河南省科技攻關計劃項目(182102110448)和信陽師范學院“南湖學者獎勵計劃”青年項目(2016)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31400213), the Science and Technology Research Projects of Henan Province (182102110448), and the Nanhu Scholars Program for Young Scholars of XYNU (2016).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190902.1502.004.html