劉彩明 王成云 郭會清 林君峰 鄒慧萍 謝堂堂

1. 深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院 (中國) 2. 鄭州海關(guān) 技術(shù)中心 (中國) 3. 深圳海關(guān) 工業(yè)品檢測技術(shù)中心 (中國)

百菌清與真菌細(xì)胞中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(含有L-半胱氨酸的蛋白質(zhì))結(jié)合，可使該酶失去氧化還原作用，從而破壞真菌細(xì)胞的新陳代謝，導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡。因此，百菌清具有良好的殺菌性能[1]。在農(nóng)業(yè)上，大量百菌清用作殺菌劑和水果的保鮮劑；在工業(yè)上，百菌清廣泛用作紙張、皮革、涂料和面料等物品的防霉劑[2-3]。但百菌清本身是一種強致敏物，易引發(fā)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)性皮炎[4]。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)于2017年10月27日將其列入2B類致癌物清單。歐盟委員會于2019年4月29日簽署法規(guī)(EU)2019/677，不再批準(zhǔn)使用百菌清。已有大量相關(guān)文獻報道了環(huán)境樣品、皮革、涂料和食品等試樣中百菌清的測定，但迄今為止，紡織品中百菌清殘留量的測定法研究尚屬空白。氣相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜(GC/MS-MS)具有基底干擾少、基線噪聲低和靈敏度高等特點[5-6]。本文采用超聲萃取技術(shù)提取紡織品中殘留的百菌清，對提取液進行GC/MS-MS測定，從而建立了1種測定紡織品中百菌清殘留量的氣質(zhì)聯(lián)用分析方法，可用于市售紡織品中百菌清殘留量的檢測。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

6890A-7000B型三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；QYB-3型自動制樣機(中山市啟元機械科技有限公司)；AS5150BD型超聲波清洗器(美國Auto Science公司)；Buchi/R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；0.45 mm有機相針式濾器(尼龍)(德國CNW Technologies公司)； EVA50氮吹儀(北京普力泰科儀器有限公司)。

百菌清標(biāo)準(zhǔn)樣(德國Dr. Ehrenstorfer公司)；色譜純甲醇(美國Fisher Scientific公司)；分析純試劑(深圳市佳銘試劑有限公司)。先用色譜純甲醇配制質(zhì)量濃度為428 g/mL的百菌清標(biāo)準(zhǔn)儲備液，然后用甲醇將其分別稀釋至質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.1、2.1、5.4、10.7和21.4 g/mL。

試驗選用不含百菌清的白棉襯布、滌綸襯布、尼龍襯布和羊毛襯布為基材，采用浸漬-焙烘法自制了4種含有不同百菌清量的陽性試樣，用于優(yōu)化本研究的試驗提取條件。

1.2 試樣前處理

用自動制樣機將試樣裁成5 mm×5 mm的碎片，混勻后稱取1.0 g試樣，置于35 mL玻璃反應(yīng)瓶中，加入30 mL乙酸乙酯，45 ℃下超聲萃取35 min。用雞心瓶收集萃取濾液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在真空下旋蒸至近干燥，再用氮吹儀緩慢吹干。殘留物用1 mL甲醇溶解，所得溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上機測試。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

進樣口和傳輸線溫度分別為270 ℃和280 ℃；載氣為He，載氣純度大于99.999%，載氣流速為1 mL/min；色譜柱為DB-5MS Ultra Inert (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：初溫90 ℃，恒溫1 min后以40 ℃/min的速度升至290 ℃，恒溫2 min；脈沖不分流進樣，進樣量為1.0 μL；溶劑延遲時間為3 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源溫度為290 ℃，四極桿溫度為150 ℃，氮氣流速為1.5 mL/min，氦氣流速為2.25 mL/min，電離方式為電子轟擊(EI)，電離能為70 eV，采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)模式，定性子離子對質(zhì)荷比(m/z)為m/z266→m/z231，定量子離子對為m/z266→m/z266，駐留時間均為150 ms，碰撞電壓均為15 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化

在脈沖不分流進樣條件下，影響質(zhì)譜信號強度的3個因素分別是進樣口溫度(A)、離子源溫度(B)和載氣流速(C)。首先，單獨考察因素A、B和C對質(zhì)譜信號強度的影響，結(jié)果表明，當(dāng)3個因素的設(shè)定值分別為260 ℃、280 ℃和1.2 mL時，百菌清的信號強度達(dá)最大。因此，本文采用正交試驗，分別對不同條件下的百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測試。百菌清溶液的峰面積測試結(jié)果如表1所示。根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)計算各因素的極差，確定優(yōu)化試驗方案為A3B3C2，即進樣口溫度、離子源溫度、載氣流速分別為270 ℃、290 ℃和1.0 mL時，百菌清溶液有最大的峰面積值。

表1 分析條件正交試驗表

在優(yōu)化條件下對百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液進行全掃描質(zhì)量分析，從其質(zhì)譜圖中選出強度較大的3個離子碎片(m/z266、m/z264和m/z268)作為母離子。在碰撞電壓為15V的條件下，采用電子轟擊掃描模式對這3個母離子進行碰撞，母離子在碰撞池與氦氣碰撞后均產(chǎn)生多個子離子。每個母離子與其產(chǎn)生的1個子離子可形成1個子離子對。對于每個母離子，根據(jù)子離子對的響應(yīng)，選擇響應(yīng)最大的2～3個子離子對進行質(zhì)譜條件優(yōu)化試驗。為提高每個離子對的數(shù)據(jù)采集質(zhì)量，將整個質(zhì)譜掃描過程劃分為不同的時間段，每個時間段有多個掃描通道[6]。改變碰撞電壓，分別觀察各子離子對在5、10、15、20、25、30、35、40、45和50 V電壓下的響應(yīng)，從中選擇響應(yīng)最大的2個子離子對進行定量和定性分析，其中響應(yīng)最大的子離子對用于定量分析，此時對應(yīng)的碰撞電壓即為優(yōu)化碰撞電壓。經(jīng)比較，最終選擇用于定量定性分析的子離子對分別為m/z266→m/z266和m/z266→m/z231，其中定量子離子對為m/z266→m/z266，2個子離子對的碰撞電壓均為15 V，駐留時間均為150 ms。在此條件下，對百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液進行分析，其GC/MS-MS質(zhì)譜信號強度與時間的關(guān)系如圖1所示，在5.661 min處有1個對應(yīng)于百菌清的尖銳譜峰。

圖1 百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液的GC/MS-MS圖

2.2 超聲萃取條件的優(yōu)化

為分析萃取溶劑種類、萃取溫度(A)、萃取時間

(B)和萃取溶劑體積(C)因素對超聲萃取效率的影響[7]，本文自制了4種含有不同百菌清含量的陽性試樣并選用丙酮進行萃取。首先，分別考察這3個因素對百菌清萃取量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種試樣的萃取量達(dá)到最大值時的萃取溫度、萃取時間和萃取溶劑體積各不相同。其中，1#、2#、3#和4#試樣萃取量達(dá)到最大值的萃取時間分別為30、30、35和35 min，萃取溫度分別為40、35、40和40 ℃，萃取溶劑體積分別為20、30、20和25 mL。然后，設(shè)計3因素3水平的正交設(shè)計試驗，分析上述3個因素對萃取量的綜合影響。在9種正交試驗條件下對4種試樣分別進行萃取，測定百菌清的萃取量。4種試樣的萃取量及總萃取量結(jié)果如表2所示。萃取溫度、萃取時間與萃取溶劑體積這3個因素的k值和極差值計算結(jié)果如表3所示。由表3可知，4種試樣的超聲萃取優(yōu)化方案均不同，但優(yōu)化的萃取溫度都是A3，而萃取時間和萃取體積則各不相同。根據(jù)等權(quán)重多指標(biāo)評價法，將總萃取量作為最終評價指標(biāo)，綜合考慮，最終確定優(yōu)化超聲萃取方案為A3B3C3。

表2 超聲萃取正交試驗表

在給定的優(yōu)化萃取條件下，以常見的11種溶劑為萃取溶劑分別萃取4種試樣的百菌清含量，萃取結(jié)果如表4所示。1#和3#試樣萃取溶劑分別為二氯甲烷和乙醇，2#和4#試樣適宜的萃取溶劑為乙酸乙酯。為確保最終選定的萃取溶劑對所有試樣都有較好的萃取效果，根據(jù)等權(quán)重多指標(biāo)評價法，將總萃取量作為判斷依據(jù)。則當(dāng)采用乙酸乙酯為萃取溶劑時，百菌清的總萃取量可達(dá)最大值。綜合考慮，以30 mL乙酸乙酯為萃取溶劑，45 ℃條件下超聲萃取35 min作為百菌清的最終萃取條件。

表3 正交試驗數(shù)據(jù)分析

表4 不同萃取劑的萃取量 單位：mg/kg

2.3 方法的線性范圍和定量下限

在上述分析條件下，測試了在質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.1、2.1、5.4、10.7和21.4 g/mL時百菌清標(biāo)準(zhǔn)工作液的響應(yīng)，以質(zhì)量濃度(ρ)和相應(yīng)的峰面積(S)作圖得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)百菌清質(zhì)量濃度處于0.2 ～ 21.4 g/mL范圍時，質(zhì)量濃度與相應(yīng)的峰面積之間存在良好的線性關(guān)系，其線性方程為A=14781ρ- 557，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999。GC/MS-MS的噪聲很低，信噪比(S/N)很好。但不能直接根據(jù)S/N來計算方法的定量下限(LOQ)，于是改用LOQ=10sb/b的方法計算LOQ[8]。式中，sb和b分別為重復(fù)20次空白試驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差與線性方程的平均斜率。根據(jù)該計算式可計算出質(zhì)量方法的定量下限為0.1 mg/kg。

2.4 方法的回收率和精密度

回收率和精密度試驗均采用空白基質(zhì)測試完成，分別選用不添加百菌清的滌綸襯布、白棉襯布、羊毛襯布和尼龍襯布作為空白試樣，進行了3個不同質(zhì)量濃度水平(0.5、2.1和10.7 g/mL)的標(biāo)準(zhǔn)溶液測試，每種質(zhì)量濃度各進行9次平行試驗，測試方法的平均回收率和精密度。其中，精密度以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)評價，結(jié)果如表5所示。該分析方法的平均加標(biāo)回收率為81.3%～96.4%，精密度為3.9%～12.5%。

表5 方法的回收率和精密度

2.5 實際試樣測試

采用前文建立的方法對市售紡織品中百菌清的含量進行測定。在某種條紋針織女式棉長褲中檢出百菌清，其含量為446 mg/kg。圖2為該試樣的GC/MS-MS圖，在t=5.651 min處出現(xiàn)1個對應(yīng)于百菌清的尖銳譜峰。

圖2 某實測試樣的GC/MS-MS圖

3 結(jié)論

本文建立了1種測定紡織品中殘留百菌清含量的GC/MS-MS分析方法，并對超聲萃取條件和儀器分析條件進行了優(yōu)化。該方法簡便快速，靈敏度高，定量下限低，可用于對市售紡織品百菌清含量的測定。