黃小強,丁 輝,劉順和,黃 濤,賈 安

(黃河科技學院醫(yī)學院,河南鄭州 450063)

肝臟是人體最重要的物質(zhì)代謝器官和無法替代的免疫器官,易受到各種因素的損害,如毒素、藥物和酒精都會造成肝臟損傷[1]。如果人體長期處于肝損傷就可能導致肝纖維化、肝癌及肝功能衰竭[2]。目前臨床上多采用維生素類、核苷類及護肝類藥物,雖然能夠改善癥狀,但具有較大的局限性,并且副作用較大[3]。因此,尋找一種安全、有效的藥物更為重要。近年來,中醫(yī)藥在治療肝損傷研究方面取得巨大進步,眾所周知,中藥具有多靶點、多通路、安全有效等特點,在治療肝損傷方面具有較大優(yōu)勢[4]。

馬齒莧(PortulacaoleraceaL)為馬齒莧科(Portulacaceae)一年生草本植物,又名長壽菜、五行草、馬蜂菜等,其性寒,味酸,具有清熱解毒、涼血止血、止痢的功效[5],具有較高的藥用和食用價值[6]。研究發(fā)現(xiàn)其化學成分主要為黃酮類、生物堿類、有機酚酸類、萜類、香豆素類等[7-9],現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),馬齒莧具有抗炎、抗氧化、降血脂等功能[10-12],并在保肝方面具有突出的作用[13]。多糖是植物水提物中重要的化學成分,同時也是主要的活性物質(zhì),大量研究表明,植物多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、降血糖、調(diào)節(jié)血脂等作用[14]。但馬齒莧多糖保肝作用研究鮮見報道。本研究通過CCl4誘導小鼠急性肝損傷小鼠模型,探討馬齒莧多糖對CCl4誘導小鼠肝損傷進行藥理作用評價,并對其分子機制進行初步探討,為馬齒莧今后進一步深入開發(fā)和臨床應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

60只清潔級KM小鼠,體質(zhì)量(20±2) g,雌雄各半 由黃河科技學院實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證:SYXK(豫)2015-003；馬齒莧 購自張仲景大藥房；ELISA試劑盒:谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、A堿性磷酸脂酶(ALP)、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px) 均購自南京建成生物工程研究所;核蛋白提取試劑盒 購自碧云天生物科技有限公司;兔抗Nrf2、HO-1抗體,鼠抗β-actin抗體,山羊抗兔IgG/HRP二抗 均購于美國CST公司;其他試劑 均為分析純。

多功能酶標儀 奧地利Infinite公司;高速臺式冷凍離心機 美國賽默飛世爾科技有限公司;FY135型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海-恒科技有限公司;BS-3000A系列電子天平 上海友聲衡器有限公司;光學顯微鏡 OLYMPUS;RM2125型石蠟切片機 德國Leica公司;垂直電泳槽、多功能成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 馬齒莧多糖的制備 參考文獻[15-16],稱取1000 g馬齒莧粗粉,加入4倍量無水乙醇浸泡24 h,抽濾,60 ℃烘干濾渣,加入10倍量的蒸餾水,80 ℃溫浸2 h,共計2次,合并濾液,減壓濃縮至適量,加入無水乙醇至80%,4 ℃靜置過夜,抽濾,重復2次,收集沉淀,即為馬齒莧粗多糖,沉淀采用蒸餾水溶解,加入適量活性炭脫色后,用Sevage試劑(正丁醇∶氯仿=4∶1),在分液漏斗充分振蕩,多次除蛋白,收集上清液,然后采用減壓濃縮,真空冷凍干燥,得馬齒莧多糖,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多糖含量的測定 采用硫酸-苯酚法檢測多糖含量[17],以葡萄糖為標準品,以超純水為空白對照,在490 nm處測定吸光度A,以葡萄糖標準濃度為橫坐標,吸光度A為縱坐標,繪制標準曲線:Y=0.0091X+0.1719(R2=0.9995),測定所得馬齒莧多糖的含量為56.72 mg/g。

1.2.3 動物分組與給藥 將60只小鼠,適應性飼養(yǎng)一周后,隨機分為6組,即正常組、模型組、聯(lián)苯雙酯(200 mg/kg/d)、馬齒莧多糖低、中、高劑量組(1.5、3、6 g/kg/d,生藥量,參考2015年版《中國藥典》[5]),各組給藥體積為10 mL/kg/d體質(zhì)量,每天灌胃1次,連續(xù)灌胃給藥7 d。末次給藥后4 h,除正常組小鼠外,其他各組小鼠腹腔注射0.2%CCl4花生油10 mL/kg,禁食不禁水24 h后,各組小鼠眼眶靜脈叢取血,4000 r/min離心10 min分離血清。采血后處死小鼠并取肝臟組織用于后續(xù)實驗,并計算肝臟指數(shù)[18]。

1.2.4 小鼠血清中生化標的測定 采用ELISA試劑盒,按照試劑盒做明說檢測血清AST、ALT和ALP含量。

1.2.5 小鼠肝臟組織中生化指標的測定 稱取適量肝臟組織,置于研磨器中,加入冰冷生理鹽水,在冰水浴中進行研磨,離心,制備10%肝臟勻漿液,按照試劑盒說明書操作,檢測MDA、SOD、GSH和GSH-Px含量。

1.2.6 小鼠肝臟組織形態(tài)學檢測 參考文獻[19],從每只小鼠各取適量肝組織,置于10%甲醛溶液中固定,24 h后,使用蒸餾水沖洗至無味,然后對其進行常規(guī)的脫水、浸蠟、包埋、切片、常規(guī)蘇木素-伊紅染色后,在顯微鏡下對其進行病理學觀察。

1.2.7 Western Blot檢測小鼠肝臟細胞中Nrf-2和HO-1蛋白表達 取適量小鼠肝臟組織,采用液氮研磨法,使用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白,采用BCA試劑盒進行蛋白定量,制備樣品,采用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制備10%的分離膠和5%的濃縮膠,上樣,電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2 h后加一抗,抗體按照1∶1000稀釋,過夜,TBST沖洗3次,加入二抗1∶5000稀釋,TBST沖洗3次,ECL發(fā)光液顯影,對相應條帶進行灰度分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 馬齒莧多糖對小鼠肝臟指數(shù)的影響

肝臟指數(shù)可以反映肝組織腫脹和炎性浸潤程度[20]。從表1可知,與正常組相比,模型組小鼠的肝臟指數(shù)極顯著性增高(P<0.01),說明CCl4導致了肝臟組織腫脹和炎性浸潤,表明本實驗造模成功[13,21];與模型組相比,給藥組小鼠肝臟指數(shù)均下降,其中馬齒莧多糖中劑量組顯著性降低(P<0.05),聯(lián)苯雙酯組和馬齒莧多糖高劑量均極顯著性降低(P<0.01),說明馬齒莧多糖能夠改善CCl4誘導產(chǎn)生的肝臟組織腫脹和炎性浸潤。

2.2 馬齒莧多糖對小鼠肝功能的影響

如表1所示,與正常組相比,模型組小鼠血清中AST、ALT和ALP水平均極顯著性升高(P<0.01),說明腹腔注射CCl4能夠引起小鼠肝臟細胞損傷。與模型組相比,給藥組小鼠血清中的AST、ALT和ALP水平均下降;AST水平在馬齒莧多糖中、高劑量組均顯著性降低(P<0.05),在聯(lián)苯雙酯組極顯著性降低(P<0.01);ALT水平在馬齒莧多糖中劑量組顯著性降低(P<0.05),在聯(lián)苯雙酯組、馬齒莧多糖高劑量組均極顯著性降低(P<0.01);ALP水平在馬齒莧多糖低劑量組顯著性降低(P<0.05),在聯(lián)苯雙酯組、馬齒莧多糖中劑量組和高劑量組均極顯著性降低(P<0.01)。血清中ALT、AST和ALP升高被認為是判定急性肝損傷的重要指標[22],肝臟功能受損后,肝細胞中的ALT、AST和ALP大量外溢,導致其在血清中含量升高[23]。結(jié)果表明馬齒莧多糖各劑量組均能降低血清中AST、ALT和ALP含量,提示馬齒莧多糖能夠改善CCl4誘導產(chǎn)生的肝臟組織損傷。

表1 馬齒莧對小鼠肝臟指數(shù)和肝功能的影響

2.3 馬齒莧多糖對小鼠肝組織中氧化指標的影響

如表2所示,與正常組相比,模型組小鼠肝臟組織中MDA水平極顯著性升高(P<0.01),GSH-Px水平顯著性降低(P<0.05),SOD和GSH水平極顯著性降低(P<0.01),說明腹腔注射CCl4能夠引起小鼠肝臟組織脂質(zhì)過氧化損傷。與模型組相比,給藥組小鼠肝臟組織中MDA水平均降低,在馬齒莧多糖中劑量組中顯著性降低(P<0.05),在聯(lián)苯雙酯組和馬齒莧多糖高劑量組極顯著性降低(P<0.01);SOD水平在馬齒莧多糖低劑量組顯著性升高(P<0.05),在聯(lián)苯雙酯組、馬齒莧多糖中劑量組和高劑量組均極顯著性升高(P<0.01);GSH水平在聯(lián)苯雙酯組、馬齒莧多糖中劑量組和高劑量組均顯著性升高(P<0.05);GSP-Px水平在馬齒莧多糖中劑量組和高劑量組均顯著性升高(P<0.05),在聯(lián)苯雙酯組極顯著性升高(P<0.01)。在脂質(zhì)過氧化反應過程中,機體會產(chǎn)生大量的MDA,從而進一步導致肝細胞損傷,加重病變,因此MDA含量的高低可以直接反映肝組織損傷的程度[24];藥物的保肝性能與抗氧化能力和清除自由的能力非常密切,其中SOD、GSH和GSH-Px是機體內(nèi)重要的抗氧化酶,可以通過清除代謝產(chǎn)生的氧自由基緩解細胞氧化損傷;因此,SOD、GSH和GSH-Px活性的高低直接影響機體清除氧自由基能力的大小[25-26]。結(jié)果表明馬齒莧多糖能夠降低肝組織勻漿液中MDA水平,同時升高SOD、GSH和GSH-Px水平,提示馬齒莧多糖能夠改善CCl4誘導產(chǎn)生的肝臟組織過氧化損傷。

表2 馬齒莧多糖對小鼠肝組織中氧化指標的影響

2.4 馬齒莧多糖對小鼠肝臟組織病理學形態(tài)的影響

如圖1可知,HE染色結(jié)果顯示,正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細胞排列整齊,細胞和結(jié)構(gòu)清晰,細胞無腫脹、炎性浸潤等病理現(xiàn)象;模型組小鼠肝細胞顯著變性,肝細胞腫脹,可見細胞壞死,存在嚴重的炎性細胞浸潤現(xiàn)象,表明造模成功;與模型組相比,聯(lián)苯雙酯和馬齒莧均能夠明顯降低肝損傷程度,明顯改善肝細胞水變性、腫脹、壞死和炎性浸潤等病理現(xiàn)象。

圖1 馬齒莧多糖對小鼠肝臟組織病理學形態(tài)的影響(200×)

2.5 馬齒莧多糖對小鼠肝臟細胞中Nrf-2和HO-1蛋白表達的影響

如圖2所示,與正常組相比,模型組小鼠肝臟組織中Nrf-2核蛋白表達水平和HO-1蛋白表達水平顯著性降低(P<0.05)。與模型組小鼠相比,各給藥組小鼠肝臟組織中Nrf-2核蛋白表達水平均升高,在馬齒莧多糖低劑量組中表達水平顯著性升高(P<0.05),在聯(lián)苯雙酯組、馬齒莧多糖中劑量組和高劑量組中表達水平極顯著性升高(P<0.01);HO-1蛋白表達水平在聯(lián)苯雙酯組、馬齒莧多糖中劑量和高劑量組中均極顯著性升高(P<0.01)。

圖2 馬齒莧多糖對小鼠肝臟細胞中Nrf-2和HO-1蛋白表達的影響

CCl4是一種肝毒性物質(zhì),常用于急性肝損傷動物模型的誘導,其作用機制與氧化應激有關(guān)[27],氧化應激性損傷是肝臟疾病發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一,在肝臟中,CCl4被細胞色素P4502E1(CYP2E1)代謝為三氯甲基(CCl3·)和過氧化三氯甲基自由基(OOCCl3·)[28]。但當毒性物質(zhì)大量侵襲肝臟時,自由基會過多產(chǎn)生,導致氧化-抗氧化系統(tǒng)失去平衡,自由基氧化反應過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物還會進一步分解為MDA,從而導致嚴重的肝臟疾病[29-30]。肝臟受損后,肝細胞膜破裂,細胞內(nèi)AST、ALT等酶被釋放入血,造成血清轉(zhuǎn)氨酶的含量急劇上升[31]。

Nrf-2/HO-1通路廣泛參與心、腦、肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)等組織器官的抗氧化應激損傷,是機體最重要的內(nèi)源性保護體系之一。Nrf-2是細胞抵御氧化應激的一個重要轉(zhuǎn)錄因子,它能在活性氧或親電試劑的刺激下,轉(zhuǎn)位進入細胞核,并與抗氧化反應元件(antioxidant respon sive element,ARE)相互作用,從而誘導下游保護性Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達,達到細胞保護的作用[32]。HO-1是Ⅱ相酶中一種重要的抗氧化酶,在針對有害刺激的內(nèi)源性和外源性起源細胞保護中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。其抗氧化功能一方面與其阻止游離血紅素參與氧化反應有關(guān),另一方面,HO-1及其酶解產(chǎn)物膽紅素、CO共同發(fā)揮著抗氧化、抗炎、抑制細胞凋亡和擴血管、改善組織微循環(huán)等作用[33-34]。因此,有效調(diào)控Nrf-2/HO-1信號通路現(xiàn)已成為治療氧化應激性疾病的重要靶點[35]。

研究報道Nrf-2/HO-1信號通路的激活可以保護肝臟損傷和改善肝纖維化[36-37]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),馬齒莧多糖能夠上調(diào)肝臟中Nrf-2核蛋白和HO-1蛋白表達水平,說明馬齒莧多糖能夠通過激活Nrf-2/HO-1通路改善CCl4誘導產(chǎn)生的肝臟組織過氧化應激損傷。

3 結(jié)論

本研究采用四氯化碳誘導小鼠建立急性肝損傷動物模型,評價馬齒莧多糖對急性肝損傷的保護作用。研究結(jié)果表明,馬齒莧多糖對四氯化碳誘導的小鼠肝損傷具有較好的保護作用。馬齒莧多糖能夠降低肝損傷小鼠的肝臟指數(shù),降低小鼠血清中的AST、ALT和ALP含量,降低肝組織勻漿液中的MDA活性,同時升高SOD、GSH和GSH-Px活性,上調(diào)肝臟組織中Nrf-2細胞核蛋白和HO-1蛋白的表達水平。因此,馬齒莧多糖對四氯化碳誘導的小鼠肝損傷具有較好的保護作用,其作用機制與Nrf-2/HO-1信號通路有關(guān)。