閆志鵬,高俊宇,王瑞廷,儀慧蘭

(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

砷是一種具有致癌性的有毒元素,可通過多種途徑進入人體,通過飲用水攝入砷是最主要的途徑之一[1-2]。據(jù)不完全統(tǒng)計,全球有105個國家和地區(qū)約2億多人的飲用水中砷含量超過世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定的限值10 μg/L[3]。人體長期接觸砷化合物會誘發(fā)皮膚、心血管、生殖系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病與癌癥的發(fā)生[4]。流行病學調(diào)查顯示,長期砷暴露可導致男性精子質(zhì)量下降,增加男性不育癥風險[5-7];動物實驗發(fā)現(xiàn),飲用水砷暴露可致雄性小鼠精子質(zhì)量和數(shù)量降低,睪丸組織損傷[8-9]。目前研究認為,砷的毒性與其引發(fā)的機體氧化損傷有關(guān)[10],因此,通過改變機體抗氧化能力有可能降低砷攝入引發(fā)的毒性。

研究發(fā)現(xiàn),葡萄果皮提取物(Grape skin extracts,GSE)具有較強的抗氧化活性,其中的酚酸類、黃酮(醇)類和芪類等植物多酚是主要的活性成分[11-12]。GSE具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、保護肝臟和心血管等多種生理活性[11]。玫瑰香GSE具有較強的體外抗氧化能力,對小鼠肝臟自發(fā)性脂質(zhì)過氧化也有較好的抑制作用[13-14];葡萄籽和果皮提取物對砷誘導的大鼠心臟氧化應激具有保護作用[15],葡萄籽提取物原花青素可以緩減砷引發(fā)的雄性生殖毒性[16],但關(guān)于葡萄果皮提取物能否拮抗砷的生殖毒性未見報道。

前期實驗選用果皮色澤較深的玫瑰香葡萄,采用超聲波輔助提取技術(shù)得到了體外抗氧化能力較強的果皮提取物[13]。本研究用該果皮提取物干預砷攝入引發(fā)的雄性小鼠生殖毒性,以期為砷的生殖毒性防控提供依據(jù),同時也為葡萄果皮提取物的開發(fā)利用拓展新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GSE 采用本實驗室前期建立的方法提取,濃度以總花色苷濃度標識[13];健康雄性昆明種純系小鼠24只,體重(18±2) g 購于山西省腫瘤醫(yī)院,生產(chǎn)許可證號:SCXK(晉)2017-0001;亞砷酸鈉 美國Sigma公司;乙醇、甲醇、甲醛、二甲苯、蘇木精、氯化鈉、考馬斯亮藍 為國產(chǎn)AR級試劑;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所;戊巴比妥鈉99.03% 上海倍卓生物科技有限公司。

SB-3200超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;HC-2518R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;精密pH計 安萊利斯儀器科技(上海)有限公司;SynergyH1多功能酶標儀 美國BioTek;Olympus BX41熒光生物顯微鏡 日本Olympus。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組與處理 將小鼠按體重隨機分為4組,每組6只。第一組為陰性對照組(CK),飲蒸餾水;第二組為砷染毒組(As),飲水含10 mg/L砷(用NaAsO2配制);第三組為GSE干預組(As+GSE),在飲用10 mg/L砷的同時,隔天1次灌胃4.5 mg GSE/kg·BW,該劑量是依據(jù)GSE的體外抗氧化能力選擇的[13];第四組為GSE對照組,隔天1次灌胃4.5 mg GSE/kg·BW。實驗周期60 d,實驗期間小鼠自由取水、攝食,染毒結(jié)束前12 h禁食。

1.2.2 實驗動物的取材 參照Zeng等[9]的方法,將小鼠麻醉、稱重后解剖,取附睪用于制備精子懸液,取雙側(cè)睪丸用預冷的生理鹽水清洗,稱重。將左側(cè)睪丸用4%的中性甲醛溶液固定,右側(cè)睪丸冷凍于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 精子數(shù)量和形態(tài)的觀察 取雙側(cè)附睪,參照Zeng等[9]的方法,制備精子懸液計數(shù)精子總數(shù),并制備精子涂片,顯微鏡下觀察統(tǒng)計正常和畸形精子數(shù)目。每只小鼠計數(shù)約1000個精子,計算精子畸形率。

1.2.4 睪丸組織切片與觀察 參照Zeng等[9]的方法,取甲醛固定的睪丸組織,制備石蠟切片,經(jīng)蘇木素-伊紅染色,光學顯微鏡觀察。

1.2.5 睪丸組織氧化脅迫指標測定 取凍存的睪丸組織,加預冷的生理鹽水制成10%的組織勻漿液。采用試劑盒檢測SOD活性、GSH含量、H2O2和MDA濃度。用考馬斯亮藍比色法測定蛋白含量[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗小鼠的一般情況

實驗期間,小鼠毛發(fā)順暢,行走、飲食與對外界反應均正常,未出現(xiàn)死亡。As染毒組小鼠每日飲水量平均為5.54 mL/只,各組間飲水量無明顯差異。實驗結(jié)束時各組小鼠的體重無明顯差異。由飲水量計算可知,小鼠平均每天攝入砷的量為1.718 mg/kg·BW。

2.2 砷對小鼠睪丸系數(shù)和精子總數(shù)的影響及葡萄果皮提取物的干預效應

As組小鼠睪丸系數(shù)顯著低于蒸餾水對照組(P<0.05),說明砷攝入可導致睪丸組織萎縮;采用GSE干預后小鼠的睪丸系數(shù)略高于As組,與對照組水平相當,說明GSE對砷致睪丸萎縮有一定的緩減作用(圖1)。

圖1 葡萄果皮提取物對小鼠睪丸臟器系數(shù)的影響

經(jīng)精子計數(shù)發(fā)現(xiàn)(圖2),As組小鼠的精子總數(shù)減少,顯著低于蒸餾水對照組(P<0.05),表明砷攝入能減少小鼠的精子數(shù)量,與其它小鼠品系中得到的結(jié)果一致[8-9];采用GSE干預后小鼠的精子總數(shù)顯著提高(P<0.05),與對照組無顯著性差異(P>0.05),表明GSE能有效改善砷攝入引發(fā)的小鼠精子減少。

圖2 葡萄果皮提取物對小鼠精子總數(shù)的影響

2.3 砷對小鼠精子的致畸作用及葡萄果皮提取物的干預效應

精子形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)(圖3),As組中7種精子畸變類型的比率均高于對照組,總精子畸形率顯著高于蒸餾水對照組(P<0.05),是對照組的2.25倍。其中,尾折疊畸形率最高,其次是不定型頭、香蕉頭、胖頭和無鉤,雙頭和雙尾畸形率相對較低。GSE干預組的精子畸形率顯著低于As組(P<0.05),說明一定劑量的GSE能夠緩解砷對小鼠精子的損傷。

圖3 葡萄果皮提取物對小鼠精子畸形率的影響

2.4 砷對小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的損傷及葡萄果皮提取物的干預效應

光學顯微鏡下,對照組小鼠睪丸組織生精小管排列規(guī)則、緊密,生精上皮細胞結(jié)構(gòu)完整、排列緊密且層次分明,各發(fā)育階段精細胞均可見,管腔內(nèi)有大量成熟精子(圖4A);As組生精小管間間隙增大,基膜出現(xiàn)破損,生精細胞排列疏松且不規(guī)則,生精小管管腔內(nèi)成熟精子較少(圖4 B);GSE對照組結(jié)構(gòu)正常(圖4D),GSE干預組與As組相比,生精小管間間隙較小,基膜完整性較好,生精小管內(nèi)生精細胞排列較規(guī)整,生精小管管腔內(nèi)成熟精子數(shù)量有所增加。

圖4 葡萄果皮提取物對小鼠睪丸組織病理的影響(200×)

2.5 砷對小鼠睪丸組織的氧化損傷及葡萄果皮提取物的干預效應

SOD和GSH是生物體抗氧化系統(tǒng)的主要成員,在機體受到氧化脅迫時,體內(nèi)的SOD活性和GSH含量會誘導性增高,參與對活性氧的清除,以維持機體的氧化還原平衡。本研究中,As組小鼠睪丸組織SOD活性和還原型GSH含量顯著降低(P<0.05),H2O2和MDA濃度顯著升高(P<0.05),說明砷暴露使睪丸組織中活性氧水平升高,引發(fā)抗氧化能力降低和組織氧化損傷效應。采用GSE干預后,睪丸組織中SOD活性和還原型GSH含量顯著升高(P<0.05),H2O2和MDA濃度顯著降低(P<0.05),表明攝入GSE能提高組織的抗氧化能力,從而減輕砷的氧化損傷效應。

圖5 葡萄果皮提取物對小鼠睪丸組織氧化脅迫指標的影響

3 討論與結(jié)論

飲用水砷攝入影響著2億多居民的健康,阻止或干預砷毒性對于改善砷攝入人群的健康狀況至關(guān)重要。小鼠飲用含砷5或50 mg/L的水6個月后,血清睪酮水平降低,精子質(zhì)量下降、數(shù)量減少,睪丸組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理性損傷[9]。本研究中昆明種小鼠飲用含砷10 mg/L的水60 d后,As組小鼠得到與C57BL/6小鼠[9]一致的結(jié)果,說明砷對實驗動物的生殖毒性具有普遍性,文中建立的昆明小鼠生殖毒性模型具有較好的代表性。本實驗采用一定劑量的GSE進行干預后,砷對小鼠的雄性生殖毒性被抑制,表明本研究選用的GSE能有效緩解砷的生殖毒性。

在深色葡萄果皮中酚酸類物質(zhì)約占到果皮多酚的70%以上,主要包括香豆酸、沒食子酸和咖啡酸等,黃酮類及黃酮醇類約占20%,主要包括槲皮素、山奈酚和原花青素等,芪類物質(zhì)含量較少,大部分為白藜蘆醇及其反式異構(gòu)體[18]。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可以通過降低肝臟中的砷積累和氧化應激來緩減As2O3的肝毒性[19],兒茶素和鞣花酸對砷致小鼠生殖毒性具有緩解效果[20-21],高劑量的原花青素對砷致雄性小鼠生殖毒性具有明顯的拮抗作用[22]。本研究在小鼠攝入砷的同時用玫瑰香GSE進行灌胃干預,可使睪丸組織的抗氧化能力提高、砷的雄性生殖毒性降低,說明砷的生殖毒性與氧化損傷效應有關(guān),灌胃GSE能提高機體抗氧化能力、緩解砷的生殖毒性,GSE含有的多種活性成分在機體解毒過程中發(fā)揮了重要作用。

研究表明,砷引起的機體損傷是自由基的過量產(chǎn)生和內(nèi)源保護性抗氧化能力降低共同作用的結(jié)果[23]。本研究中As組小鼠睪丸組織SOD活性和還原型GSH含量降低,H2O2和MDA濃度提高,說明經(jīng)飲用水攝入砷對小鼠睪丸組織造成了氧化損傷,砷暴露能誘導睪丸組織產(chǎn)生過多的活性氧自由基;清除活性氧需要消耗體內(nèi)的SOD和還原型GSH,同時砷和自由基對巰基具有較強的結(jié)合力,導致細胞還原力下降;而大量自由基堆積可引起脂質(zhì)過氧化程度加重,使MDA濃度增高。在本研究中,給砷攝入小鼠灌胃GSE能提高小鼠睪丸組織的SOD活性和還原型GSH含量,降低H2O2和MDA濃度,可能是GSE中的酚酸類成分、維生素C等能夠通過供氫、淬滅單線態(tài)氧、螯合以及還原等作用清除自由基[12],從而保護了抗氧化酶和非酶系統(tǒng)的活性,提高了組織的抗氧化能力,繼而對組織器官的功能和結(jié)構(gòu)進行保護,表現(xiàn)為睪丸系數(shù)、精子總數(shù)與質(zhì)量的改善。

本研究結(jié)果表明,飲用水攝入砷可引發(fā)雄性生殖毒性,導致睪丸組織抗氧化能力降低、組織結(jié)構(gòu)損傷,精子質(zhì)量和數(shù)量降低。葡萄果皮提取物對砷攝入引起的雄性生殖毒性具有良好的緩解作用,能改善組織的抗氧化能力,提高精子質(zhì)量和數(shù)量,保護睪丸組織結(jié)構(gòu)。