沈海波,張連鋼,周鑫魁,方劍儒,洪 霞,劉善鑫,莫慧娟,張婧蕾

(1. 嘉峪關(guān)市食品藥品和醫(yī)療器械檢驗檢測中心,甘肅嘉峪關(guān) 735100;2.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗檢測有限公司,甘肅蘭州 730010;3.張掖市藥品檢驗檢測中心,甘肅張掖 734000)

現(xiàn)有方法中,無法同時滿足靈敏度高、噪聲小、操作簡單的實驗要求,因此建立一種操作相對簡便的樣品處理方法和一種高靈敏度,檢測結(jié)果穩(wěn)定,自動化程度高的檢測方法是很有必要的,在已經(jīng)公開發(fā)表的文獻中尚未報道有如何利用熒光衍生-高效液相色譜法測定痕量維生素C的方法,所以本文將高靈敏度的熒光衍生方法與高效快速的液相色譜法相結(jié)合,建立一套靈敏度高、操作相對簡便、穩(wěn)定的食品中痕量維生素C測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

維生素C標準品 標準品(97.5%),德國Dr. Ehrenstorfer公司;6-羥基-2,4,5-三氨基嘧啶 優(yōu)級純,上海麥克林生化科技有限公司;草酸 分析純,上海中秦化學試劑有限公司;乙酸鈉 分析純,上海中秦化學試劑有限公司;新鮮水果蔬菜樣品 均購于超市及農(nóng)貿(mào)市場。

20A高效液相色譜儀 島津企業(yè)管理中國有限公司;XB220電子天平 普利賽斯國際貿(mào)易(上海)有限公司;RX-II型離心機 天美中國科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理方法 稱取5.00 g粉碎或勻漿后的樣品(包括蔬菜水果及其制品、乳及乳制品、蛋類、肉類、菌類、水產(chǎn)品),于50 mL離心管中,加入提取試劑1%草酸水溶液定容至50 mL,渦旋提取2 min,超聲提取5 min;將上述離心管于8000 r/min離心3 min,取上清液備用。

1.2.2 衍生方法 取上清液5 mL于15 mL離心管中,用飽和乙酸鈉調(diào)節(jié)pH為6.0～7.0,加入1 mL衍生試劑,40 ℃避光反應(yīng)0.5 h。取清液過濾孔直徑為0.22 μm的濾膜,高效液相色譜儀測定。

1.2.3 色譜條件及標準曲線繪制 色譜柱:C18柱(5 μm,4.6 mm×150 mm);流動相:pH=4.0乙酸銨緩沖液(v)+乙腈(v)+甲醇(v)=80+15+5,等度洗脫;流速:1 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:20 μL;激發(fā)波長:373 nm,發(fā)射波長:442 nm。

配制七個不同質(zhì)量體積濃度的維生素C標準溶液,質(zhì)量體積濃度分別為:0.05、0.10、0.50、2.50、10.0、50.0、500.0 μg/mL;將維生素C標準溶液按1.2.2處理,按1.2.3色譜條件進入附帶熒光檢測器的高效液相色譜儀中測定,繪制標準曲線,并計算樣品中維生素C的含量。

1.2.4 樣品提取溶劑選擇 樣品中維生素C提取方式以溶液浸提法為主,根據(jù)文獻[4,6-7,15]提取液分別為1%草酸水溶液、2%偏磷酸水溶液、1%鹽酸水溶液、二次蒸餾水。分別以四種溶液為樣品提取溶劑,分別按照1.2.1和1.2.2方法步驟處理標識值為322 μg/g的乳粉樣品。根據(jù)檢測結(jié)果及實驗現(xiàn)象,比較四種提取溶劑。

1.2.5 衍生試劑的選擇 檢測痕量維生素C時常用熒光分光光度法,其衍生劑為鄰苯二胺水溶液。分別使用鄰苯二胺和6-羥基-2,4,5-三氨基嘧啶為衍生試劑。參考國標GB5413.18-2010方法[9]對標識值322 μg/g的乳粉樣品進行衍生并檢測其中維生素C的含量。

1.2.6 衍生最佳pH范圍確定 按照1.2.2方法,用飽和乙酸鈉及氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)5 mL的100 ng/mL標準溶液pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,分別加入等量衍生液,用超純水定容至10 mL,于40 ℃衍生0.5 h。在1.2.3色譜條件下測定不同pH下衍生液中維生素C含量。

1.2.7 衍生溫度及衍生時間研究 按1.2.1方法處理維生素C含量標識值為49.2 μg/g的陽性乳粉樣品,在pH為6.5±0.5條件下,參考文獻[10]中的方法,同時進行衍生溫度及衍生時間的棋盤實驗,每種條件下做三組平行試驗,并按照1.2.3色譜條件檢測每種衍生條件的維生素C含量。

表1 不同提取液處理樣品對比結(jié)果

1.2.8 衍生試劑濃度研究 稱取一定量6-羥基-2,4,5-三氨基嘧啶,配制成0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 g/L不同濃度的6-羥基-2,4,5-三氨基嘧啶水溶液。以六種濃度溶液,分別為衍生劑,在最佳衍生條件下對50 ng/mL的維生素C標準溶液進行衍生反應(yīng),并測定衍生產(chǎn)物含量。

1.2.9 方法檢出限 按照1.2.3色譜條件檢測空白樣品,得到30 min空白樣品基線色譜圖,以30 min內(nèi)最大基線噪聲的三倍為儀器最低的可識別信號,作為儀器檢出限。根據(jù)方法稀釋倍數(shù)計算方法檢出限。

1.2.10 維生素C含量的計算 根據(jù)1.2.2測得的樣品制備液的峰面積值,從1.2.3繪制的系列維生素C標準溶液的工作曲線上找到峰面積值對應(yīng)的維生素C的含量,按下式計算待測食品中維生素C的含量X:

式中:X表示試樣中的維生素C含量,單位μg/g;ρ表示1.2.3步驟由標準曲線測得的樣品制備液的峰面積所對應(yīng)的維生素C的含量,單位μg/mL;m表示試樣質(zhì)量,單位g;V表示1.2.1步驟中定容體積,單位mL;f表示稀釋倍數(shù),本實驗中為1;1000表示單位μg/g在適用情況下,可以轉(zhuǎn)化為mg/kg的系數(shù),可以不使用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗用相關(guān)分析,對應(yīng)分析,回歸分析,處理分析數(shù)據(jù),得到相關(guān)結(jié)論。用Excel軟件繪制圖表,使數(shù)據(jù)結(jié)果更直觀。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取液選擇

四種提取液處理同一乳粉樣品中維生素C含量檢測結(jié)果如表1所示。

由表1可知,由于二次蒸餾水無法有效沉淀蛋白質(zhì),二次蒸餾水在提取蛋類、乳及乳制品類樣品時,通過離心和過濾操作無法獲得上清液;鹽酸在溶液中無法與Fe3+、Cu2+形成絡(luò)合物,所以1%鹽酸水溶液提取含F(xiàn)e3+、Cu2+較多的樣品時,Fe3+、Cu2+可以結(jié)合維生素C形成絡(luò)合物[21],導致所測維生素C含量偏低;以偏磷酸和草酸提取效果最佳,而偏磷酸不易溶于水,在實際操作中,配制偏磷酸溶液耗時長;為更快速、有效的測定食品中維生素C的含量,本實驗采用1%草酸水溶液做樣品提取液。

2.2 衍生試劑對比

鄰苯二胺衍生產(chǎn)物為苯并含氧六元雜環(huán)。而本方法熒光衍生劑采用6-羥基-2,4,5-三氨基嘧啶,衍生產(chǎn)物為嘧啶并含氧六元雜環(huán),且在嘧啶環(huán)上有鄰對位的氨基和羥基,氨基和羥基為給電子基團,能使得嘧啶并含氧六元雜環(huán)的電子共軛區(qū)域增大,大幅增加衍生產(chǎn)物的熒光強度。在液相色譜中得到更強的熒光信號,從而有利于提高方法的靈敏度,更適合用于痕量維生素C的檢測工作中。分別在兩種不同的衍生劑最佳衍生條件下,充分衍生同濃度的維生素C,并測定其熒光強度,對比目標物色譜峰面積,維生素C濃度相同的條件下,色譜峰面積越大,證明其熒光強度越強。兩種衍生劑所得到的色譜圖如圖1所示。結(jié)果表明,6-羥基-2,4,5-三氨基嘧啶的衍生產(chǎn)物的熒光強度是鄰苯二胺的衍生產(chǎn)物的1.83倍。

圖1 兩種衍生劑衍生產(chǎn)物的色譜圖

2.3 衍生最佳pH范圍確定

以衍生pH為橫坐標,衍生產(chǎn)物液相色譜峰面積為縱坐標,得到該曲線。如圖2所示。

圖2 不同pH環(huán)境中衍生效果對比

由圖2可知,pH環(huán)境對衍生反應(yīng)影響很大,偏酸或偏堿性溶液都不利于羰基與氨基的縮合反應(yīng),阻礙衍生進行。所以選擇維生素C與衍生劑反應(yīng)的最佳pH環(huán)境為6～7之間,實驗選擇在pH為6.5±0.5范圍進行衍生反應(yīng)。

2.4 最佳衍生溫度及衍生時間

每組試驗得到三組數(shù)據(jù),對比結(jié)果,選出最佳衍生溫度及衍生時間。條件及結(jié)果如表2所示。

表2 不同衍生反應(yīng)時間及衍生溫度棋盤試驗結(jié)果

由表2可知,當衍生溫度為40 ℃,衍生時間為30 min時,測得樣品中維生素C含量為47.5 μg/g,回收率為96.5%。完全滿足檢測要求。當反應(yīng)溫度超過40 ℃,反應(yīng)時間大于30 min時,檢測得到目標物含量并沒有明顯增加,反而由于時間過長,溫度過高,導致衍生產(chǎn)物有微弱分解現(xiàn)象。所以選擇最佳衍生溫度為40 ℃,最佳衍生時間為30 min。

表3 線性范圍,回歸方程,相關(guān)系數(shù),檢出限

2.5 衍生液濃度優(yōu)化

衍生試劑濃度對檢測結(jié)果的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 衍生液濃度對衍生反應(yīng)的影響

由圖3可知,隨衍生液濃度的升高,衍生產(chǎn)物的含量逐漸增加,當濃度增加到1.0 g/L時,繼續(xù)增加衍生液濃度,衍生產(chǎn)物含量并沒有明顯增加。因為當衍生液濃度在一定范圍時,隨衍生液濃度增加,衍生反應(yīng)也會隨之加快,一定時間內(nèi)表現(xiàn)出的現(xiàn)象就是衍生產(chǎn)物含量增加。當衍生液濃度到達某一值時,衍生速度達到最快,繼續(xù)增加衍生液濃度,并不能更好的加快反應(yīng)速度,所以為節(jié)約成本,選用衍生速度達到峰值所對應(yīng)衍生液的濃度1.0 g/L即可。

2.6 色譜條件選擇

流動相pH環(huán)境選擇,當流動相pH大于4時,色譜圖中目標峰會變寬,保留時間變大(如圖4A)。是由于色譜柱固定相載體球形硅膠對目標物的羥基有一定的吸附能力,當pH減小,酸性增強時硅膠吸附能力減弱,得到的色譜峰形狀尖銳,對稱(如圖4B)。當流動相pH小于4時,保留時間變小,影響目標峰與雜質(zhì)峰的分離效果(如圖4C)。所以選擇流動相pH環(huán)境為4.0。

流動相中有機相選擇,當單獨使用乙腈+水作為流動相時,該目標物色譜峰會產(chǎn)生前延現(xiàn)象(如圖4D)。所以選用pH=4.0乙酸銨緩沖液(v)+乙腈(v)+甲醇(v)=80+15+5作為流動相時,避免前延和拖尾現(xiàn)象,保證峰形良好。

圖4 不同流動相得到的不同色譜圖

2.7 線性方程、線性范圍、相關(guān)性系數(shù)、最低檢出限

繪制維生素C標準溶液的工作曲線;該標準曲線的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、儀器檢出限(3倍信噪比)值見表3。

由表3可知,該方法線性范圍寬,相關(guān)性系數(shù)良好,3倍信噪比(儀器檢出限)低,樣品處理方法為10倍稀釋,所以該方法檢出限為0.2 μg/g。較國標方法和已報道的文獻方法更靈敏,完全適合痕量維生素C的檢測。

2.8 回收率及精密度試驗

按照1.2.3方法分別處理維生素C含量標識值為49.2、15.4、5.7 μg/g的陽性樣品,每種樣品平行處理8次,并檢測其中維生素C的含量。計算每種濃度水平的平均回收率和相對標準偏差(relative standard deviation,RSD),結(jié)果見表4。

表4 3個水平下維生素C回收率試驗結(jié)果

表5 不同方法對不同樣品中維生素C含量測定結(jié)果

由表4可知,該方法回收率為90.9%～96.7%,RSD%≤2%,證明該方法結(jié)果穩(wěn)定,滿足檢測要求。

2.9 實際樣品測定及方法對比

分別采用本方法(方法檢出限為0.2 μg/g),國標方法[6](方法檢出限為1 μg/g)和液相色譜-紫外檢測器方法[12](方法檢出限為6 μg/g)對維生素C含量較多的樣品(包括:乳粉、沙棘、新鮮果蔬等)和維生素C含量非常少的樣品(包括:菌類、魚類、雞蛋等)進行測定,結(jié)果見表5。

由表5可知,液相色譜紫外檢測器方法,收到檢測器自身靈敏度限制,對含量10 μg/g以下樣品無法準確測定。國標方法采用靈敏度較高熒光分光光度法,但受到衍生產(chǎn)物熒光強度限制,對含量1 μg/g以下樣品無法準確測定;同時無法分辨所測得的熒光強度是由維生素C衍生產(chǎn)生的熒光,還是由樣品中不易除去的雜質(zhì)所產(chǎn)生的熒光,所以測量值不穩(wěn)定;自建液相色譜熒光檢測器方法,克服以上兩種方法缺點,具有高靈敏度的同時,也降低背景及噪聲對檢測結(jié)果的影響,適合各類樣品中維生素C的檢測工作。

3 結(jié)論

結(jié)合液相色譜高自動化,高穩(wěn)定性的優(yōu)點。利用高靈敏度的熒光檢測器,選擇高強度熒光衍生試劑初步建立了一種實驗操作簡單,檢測結(jié)果準確度高,穩(wěn)定性良好,方法檢出限低,靈敏度高,適合各類食品中痕量維生素C檢測的方法。并將該方法實際應(yīng)用在日常檢測工作中,有望將該方法推廣至其他領(lǐng)域,同時也為烯二醇類物質(zhì)的熒光衍生方法及檢測方法提供研究參考。