梁夢(mèng)潔,黃麗佳,劉 欣,李 晶,宋春滿(mǎn),張建鐸,*

(1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,云南昆明 650106;2.昆明醫(yī)科大學(xué),云南昆明 650500)

生物胺是一類(lèi)主要由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成的弱堿性低分子量含氮化合物,常存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi),食品在發(fā)酵或腐爛過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生生物胺[1]。發(fā)酵乳制品、酒類(lèi)、水產(chǎn)品、肉類(lèi)產(chǎn)品、調(diào)味液等富含蛋白質(zhì)和氨基酸的食品廣泛存在生物胺[2]。微量的生物胺是生命體內(nèi)生成荷爾蒙、核酸、蛋白質(zhì)等的前體物質(zhì),在生物細(xì)胞中具有重要的生理功能,但攝入過(guò)量含有生物胺的食品,會(huì)引起中毒,甚至危及性命[3-4]。

蜂蜜是人們喜愛(ài)的一種保健食品,含有少量蛋白質(zhì)和多種游離氨基酸[5],并含多種適宜微生物生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),在酸性環(huán)境下易生成生物胺。蜂蜜在加工和儲(chǔ)存過(guò)程中均有可能被微生物侵染而產(chǎn)生生物胺。目前有關(guān)蜂蜜中生物胺種類(lèi)和檢測(cè)方法鮮有報(bào)道,僅見(jiàn)趙玲玲等[6]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)了蜂蜜中8種生物胺含量,而高效液相色譜分析蜂蜜中生物胺含量未見(jiàn)報(bào)道。因此有必要建立簡(jiǎn)便的高效液相色譜分析蜂蜜中生物胺的方法。

目前,分析生物胺的常用方法主要有離子色譜法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]、高效液相色譜法[9]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]等。其中高效液相色譜法因?qū)x器配置要求不高而廣為應(yīng)用,但液相色譜法需要將樣品衍生化處理后才能檢測(cè)。衍生化處理分為柱前衍生和柱后衍生兩種。柱后衍生法需要專(zhuān)用的衍生設(shè)備,因此柱前衍生-高效液相色譜法分析生物胺應(yīng)用更廣。柱前衍生法主要有FITC衍生法、OPA衍生法,苯甲酰氯衍生法和丹磺酰氯衍生[12-13],其中丹磺酰氯衍生因簡(jiǎn)便穩(wěn)定被廣為應(yīng)用[14-15]。影響丹磺酰氯衍生反應(yīng)的主要因素有衍生體系pH、衍生時(shí)間和衍生溫度。不同文獻(xiàn)的衍生條件各不相同,也有文獻(xiàn)對(duì)衍生條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化[16]或正交設(shè)計(jì)優(yōu)化[17],但這些實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)未能考慮因子的交互作用。為了確定丹磺酰氯衍生法測(cè)定蜂蜜中生物胺含量的最佳衍生條件,本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法,對(duì)衍生體系pH、衍生溫度和時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,便于蜂蜜中生物胺含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈 色譜純，美國(guó)Fisher公司;丹磺酰氯 美國(guó)Sigma-Aldrich公司，純度99.5%;標(biāo)準(zhǔn)品色胺、酪胺、組胺、尸胺、腐胺、精胺、亞精胺 純度均大于99.0%,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;HCl、HClO4、NaOH、NaHCO3、氨水 均為分析純,西隴化工有限公司;冠生園蜂蜜(油菜蜂蜜、楊槐蜂蜜和荊條蜂蜜的混合蜜) 上海冠生園蜂制品有限公司。

Agilent 1200高效液相色譜儀(配備G1312B二元泵,G1367D自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316B柱溫箱和G1315C二極管陣列檢測(cè)器) 美國(guó)Agilent公司;Agilent 7696樣品處理工作臺(tái)(配備自動(dòng)衍生功能模塊) 美國(guó)Agilent公司;Biofuge Stratos離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;Sartorius PB-10酸度計(jì) 德國(guó)Sartorius公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別準(zhǔn)確稱(chēng)取腐胺、精胺、尸胺、亞精胺和組胺標(biāo)準(zhǔn)品100 mg于100 mL容量瓶中,用0.1 mol/L鹽酸溶解定容,配成1.0 mg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,分別移取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于容量瓶中,用0.4 mol/L HClO4稀釋成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品提取 稱(chēng)取0.5 g蜂蜜至5 mL離心管中,精確至0.01 g,加入2 mL 0.4 mol/L HClO4超聲提取45 min,8000 r/min離心10 min,取上清液衍生。

1.2.3 樣品衍生 衍生方法參考文獻(xiàn)[18],略作改動(dòng)。移取1 mL樣品提取液和1 mL 20 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)液于離心管中,加入2 mol/L NaOH溶液200 μL、飽和NaHCO3溶液300 μL、4 mg/mL丹磺酰氯溶液1 mL,渦旋混勻后密封,45 ℃避光衍生40 min,加入100 μL濃氨水,渦旋1 min,靜置30 min用乙腈定容至5 mL,渦旋混勻,8000 r/min離心5 min,上清液經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)分析。

1.2.4 分析條件 液相色譜柱:Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(100 mm×3 mm,2.7 μm);流動(dòng)相:A為0.1%乙酸銨水溶液,B為乙腈;洗脫程序:0～5 min,50%～5% A;5～7 min,5% A;7～7.5 min,5%～50% A;7.5～9 min,50% A;流速:0.5 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。檢測(cè)波長(zhǎng):345 nm。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 不同研究者采用丹磺酰氯衍生生物胺時(shí),使用的衍生條件差異較大,衍生體系pH在9.5～12[19-20],衍生溫度在30～70 ℃[21-23],衍生時(shí)間在15～60 min[24-26]。本實(shí)驗(yàn)參考多數(shù)文獻(xiàn),設(shè)計(jì)衍生體系pH、衍生溫度和衍生時(shí)間的不同水平進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察各因素對(duì)生物胺衍生物峰面積響應(yīng)的影響。

1.2.5.1 衍生體系pH對(duì)峰面積響應(yīng)的影響 設(shè)計(jì)衍生體系pH9.5、10、10.5、11、11.5和12六個(gè)水平進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),固定衍生溫度45 ℃、衍生時(shí)間40 min,考察不同衍生體系pH對(duì)生物胺峰面積響應(yīng)的影響,預(yù)選出合適pH進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.2 衍生溫度對(duì)峰面積響應(yīng)的影響 設(shè)計(jì)衍生溫度30、35、40、45、50、55 ℃六個(gè)水平進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),固定pH11、衍生時(shí)間40 min,考察不同衍生溫度對(duì)生物胺峰面積響應(yīng)的影響,預(yù)選出合適的衍生溫度進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.3 衍生時(shí)間對(duì)峰面積響應(yīng)的影響 設(shè)計(jì)衍生時(shí)間30、35、40、45、50、55 min六個(gè)水平進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),固定pH11、衍生溫度45 ℃,預(yù)選出合適的衍生溫度進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 以衍生體系pH(A)、衍生溫度(B)、衍生時(shí)間(C)為響應(yīng)因子,以各種生物胺峰面積(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。以獲取生物胺衍生反應(yīng)的最優(yōu)條件。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,pH范圍設(shè)為10～12,衍生溫度設(shè)為30～60 ℃,衍生時(shí)間設(shè)為30～50 min。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert(Ver.11)軟件處理數(shù)據(jù),每個(gè)處理平行重復(fù)3次,取平均值計(jì)算分析,繪制響應(yīng)面圖,計(jì)算擬合方程和各因素的最優(yōu)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 pH對(duì)衍生效果的影響 pH在9.5～12范圍內(nèi),5種生物胺的峰面積響應(yīng)均呈先升后降的趨勢(shì),但5種生物胺稍有差別。腐胺、尸胺和組胺在pH11時(shí)峰面積響應(yīng)最大,然后隨pH升高逐漸降低;精胺和亞精胺在pH10.5時(shí)峰面積響應(yīng)最大,然后隨pH升高而逐漸降低(圖1)。

圖1 pH對(duì)生物胺衍生物峰面積響應(yīng)的影響

2.1.2 衍生溫度對(duì)衍生效果的影響 在衍生溫度30～55 ℃范圍內(nèi),5種生物胺的峰面積響應(yīng)均為先隨溫度升高而增加,而后逐漸降低。腐胺和組胺在45 ℃達(dá)到峰面積最大值,精胺、亞精胺和尸胺在40 ℃達(dá)到最大值,而后逐漸降低。這是因?yàn)闇囟壬饶軌蚣铀傺苌磻?yīng),但過(guò)高的溫度可能破壞衍生物的穩(wěn)定性(圖2)。

2.1.3 衍生時(shí)間對(duì)衍生效果的影響 在衍生時(shí)間30～55 min范圍內(nèi),5種生物胺的峰面積響應(yīng)均為先隨衍生時(shí)間延長(zhǎng)而增加,而后逐漸降低。腐胺和組胺在40 min達(dá)到峰面積最大值,精胺、亞精胺和尸胺在45 min達(dá)到最大值,而后逐漸降低(圖3)。

2.2 回歸模型建立與參數(shù)檢驗(yàn)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)的各實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)的衍生樣品經(jīng)高效液相色譜檢測(cè),5種生物胺的峰面見(jiàn)如表2,通過(guò)Design-Expert軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),可得到各因素水平與生物胺峰面積的擬合方程如下。

腐胺:Y=1590.26-157.02A+ 36.15B+ 40.24C-19.91AB+ 175.73AC-40.11BC-877.94A2-437.08B2-227.08C2

精胺:Y=1134.28-236.08A+31.00B-22.44C-13.86AB+38.76AC-17.50BC-693.33A2-208.47B2-194.66C2

亞精胺:Y=1600.48-282.48A-34.98B-5.08C+25.29AB+147.14AC-54.09BC-706.51A2-576.16B2-446.56C2

尸胺:Y=1344.39-57.58A-17.36B+55.90C+3.73AB+272.78AC+26.09BC-884.35A2-257.20B2-62.98C2

組胺:Y=707.47-169.85A-55.23B+48.23C+32.13AB-19.36AC+112.47BC-345.59A2-159.26B2-141.38C2

5種生物胺擬合模型的方差分析與參數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3～表7,5個(gè)擬合模型P<0.0001,表明5個(gè)模型均有效,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

腐胺、精胺、亞精胺、尸胺和組胺擬合模型的校正決定系數(shù)(AdjustedR2)分別為0.9978、0.9980、0.9970、0.9989和0.9979,預(yù)測(cè)決定系數(shù)(PredictedR2)分別為0.9857、0.9755、0.9876、0.9854和0.9781。各個(gè)模型的校正R2>0.99,預(yù)測(cè)R2>0.99,表明模型擬合度高,試驗(yàn)誤差小。方差分析結(jié)果顯示,模型失擬項(xiàng)P>0.05,說(shuō)明模型不失擬,能充分反映實(shí)際情況,能很好地進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 腐胺響應(yīng)面擬合模型方差分析

腐胺、精胺、亞精胺、尸胺和組胺擬合模型的信噪比(Adeq Precision)分別為65.54、51.03、71.72、68.03和50.65,均大于4,說(shuō)明該模型響應(yīng)信號(hào)強(qiáng),可進(jìn)行真實(shí)值的分析和預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。變異系數(shù)分別為3.42%、4.77%、3.65%、3.29%和4.45%,均小于5%,說(shuō)明模型是可重復(fù)的。

5種生物胺擬合模型的一次項(xiàng)中A(pH)均影響極顯著(P<0.01);腐胺、尸胺、組胺擬合模型的一次項(xiàng)B(衍生溫度)影響極顯著(P<0.01);組胺擬合模型的一次項(xiàng)C(衍生時(shí)間)影響極顯著(P<0.01)。除精胺擬合模型外,其余模型一次項(xiàng)C均影響顯著(P<0.05)。5種生物胺擬合模型的二次項(xiàng)均影響極顯著(P<0.01)。腐胺、尸胺、亞精胺擬合模型的交互項(xiàng)AC影響極顯著(P<0.01),精胺和組胺擬合模型的交互項(xiàng)AC影響顯著(P<0.05),各交互項(xiàng)對(duì)生物胺擬合模型的影響見(jiàn)圖4,其余交互項(xiàng)均無(wú)顯著影響。根據(jù)方差分析的F值(P值)可知,3個(gè)衍生因素對(duì)生物胺響應(yīng)的影響大小依次為pH>衍生溫度>衍生時(shí)間。

表4 精胺響應(yīng)面擬合模型方差分析

表5 亞精胺響應(yīng)面擬合模型方差分析

表6 尸胺響應(yīng)面擬合模型方差分析

表7 組胺響應(yīng)面擬合模型方差分析

表8 生物胺響應(yīng)面擬合模型驗(yàn)證結(jié)果

圖4 pH和衍生時(shí)間交互作用對(duì)生物胺峰面積影響的響應(yīng)面圖

2.3 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面擬合方程進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析,得到5種生物胺最優(yōu)衍生條件如下:腐胺:pH10.92、衍生溫度45.79 ℃、衍生時(shí)間40.41 min;精胺:pH10.82、衍生溫度43.91 ℃、衍生時(shí)間40.77 min;亞精胺:pH10.77、衍生溫度43.85 ℃、衍生時(shí)間40.48 min;尸胺:pH11.05、衍生溫度43.26 ℃、衍生時(shí)間39.95 min;組胺:pH10.83、衍生溫度46.71 ℃、衍生時(shí)間38.57 min。為方便統(tǒng)一操作,生物胺最優(yōu)衍生條件設(shè)為pH11、衍生溫度45 ℃、衍生時(shí)間40 min。

在此條件下進(jìn)行2個(gè)濃度(10、20 μg/mL)的3組平行實(shí)驗(yàn),腐胺、精胺、尸胺、亞精胺和組胺5種生物胺的實(shí)際峰面積響應(yīng)與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差數(shù)值介于2.32%～4.94%,均小于5%,說(shuō)明模型能較好地預(yù)測(cè)生物胺的衍生效果,具有實(shí)際意義。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素優(yōu)化基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法建立了5種生物胺衍生化條件的響應(yīng)面模型,模型擬合度高,預(yù)測(cè)值與實(shí)際值吻合好。根據(jù)模型參數(shù)的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),各因素對(duì)衍生效果影響大小依次為pH、衍生溫度、衍生時(shí)間。最優(yōu)衍生條件為pH11、衍生溫度45 ℃、衍生時(shí)間40 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),腐胺、精胺、尸胺、亞精胺和組胺5種生物胺的實(shí)際峰面積響應(yīng)與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差數(shù)值介于2.32%～4.94%,均小于5%,說(shuō)明模型能較好地預(yù)測(cè)生物胺的衍生效果。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的最優(yōu)衍生條件對(duì)于高效液相色譜分析蜂蜜中的生物胺有實(shí)用價(jià)值。