鄒冬倩,嚴 輝,*,李鵬輝,濮宗進,周桂生,郭 盛,楊 健,黃勝良

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室,江蘇南京 210023;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心,道地藥材國家重點實驗室培育基地,北京 100700;3.江蘇融昱藥業(yè)有限公司,江蘇淮安 223001)

干姜(ZingiberisRhizoma)為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根莖,冬季采挖,除去須根和泥沙,曬干或低溫干燥[1]。干姜始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲的功效,臨床上常用于脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、肢冷脈微、寒飲喘咳等癥[2-4]。干姜中的有效成分包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、姜烯酚及姜酮等酚類成分[5],以及姜醇、姜烯等揮發(fā)性成分[6]。現(xiàn)代藥理研究表明,干姜具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、保肝等作用[7-9]。

姜作為藥食兩用的中藥,在中國已經(jīng)有2000多年的食用歷史,《論語》記載,孔子有“不撤姜食,不多食”之句。中國是姜的發(fā)源地之一,也是最早種植姜的國家。姜,適宜溫暖濕潤氣候,不耐高溫和強光,適宜土質(zhì)肥沃、土層深厚、透氣性好的沙壤土、壤土或粘壤土,這些生長特性決定了姜的分布產(chǎn)區(qū)[10-11]。除東北、西北等高寒地區(qū)以外,姜在全國各地均有分布,主產(chǎn)于四川、云南、貴州、廣西、山東、湖南等地[12]。不同的地理生態(tài)環(huán)境,其無機元素的組成也同樣存在差異[13-15]。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)土壤中的無機元素能夠影響藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累,進一步影響著藥材的質(zhì)量[16-17]。目前,關(guān)于干姜中的有效成分含量以及指紋圖譜研究較多[18-20],但是針對不同產(chǎn)地的干姜中無機元素的組成研究不夠充分[21-22]。而重金屬元素也已成為公認的對人體有害的元素[23],同時值得關(guān)注的是,目前國內(nèi)干姜主要產(chǎn)區(qū)多屬于重金屬土壤背景值較高的區(qū)域,具有潛在的重金屬超標風險,因此對干姜藥材中無機元素的組成規(guī)律的研究極為重要。

現(xiàn)今,關(guān)于中藥中的無機元素的測定方法主要為石墨爐原子吸收法(GFAAS)、原子吸收分光光度法(AAS)、火焰原子吸收光譜法(FAAS)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES),而ICP-AES是目前多元素測定最先進、最準確的技術(shù)手段[24],已廣泛應(yīng)用于食品、藥品中的無機元素的檢測[25-26]。ICP-AES能夠檢測光學(xué)光譜(165～800 nm),可以同時檢測原子光譜中的多條譜線,并且能夠同時檢測多種原子和離子,ICP-AES的檢測限較低,重現(xiàn)性較好,儀器的分析速度較快[27],因此采用ICP-AES法能夠快速、準確地分析干姜中無機元素的組成。

本研究主要采用ICP-AES法對來自云南、四川、貴州、山東等地的干姜樣品中無機元素含量進行測定,采用聚類分析和主成分分析對不同產(chǎn)地的樣品進行化學(xué)計量學(xué)分析,以期分析不同產(chǎn)地樣品的差異。對去皮與不去皮的樣品中重金屬元素的含量作比較,為干姜藥材的產(chǎn)地加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Al、As、B、Ba、Be、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、Tl、V、Zn(GSB 04-1767-2004),Na、P、K(GSB 04-1764-2004),In、Ge、Bi、Rh、Sc、Tb、Y(GSB 04-2826-2011),Hg(GSB 04-1728-2004) 國家有色金屬及電子材料分析測試中心;硝酸(優(yōu)級純) 德國默克公司;去離子水 屈臣氏蒸餾水；28批干姜藥材 經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴輝副教授鑒定為姜科(Zingiberaceae)植物姜(ZingiberofficinaleRosc.)的干燥根莖,標本存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)標本館。干姜樣品采集于2017年4～6月,置于干燥陰涼密封罐中保存,干姜樣品包含不同規(guī)格等級,以及相同規(guī)格等級的不同批次樣品,其中S9與S11為不同批次的低硫母姜,S12、S15與S20為不同批次的高硫小黃姜,S17與S18為不同批次的低硫姜片,S23與S24為不同批次的低硫未去皮小黃姜,S27與S28為不同批次的低硫去皮小黃姜,詳細信息見表1。

表1 28批不同產(chǎn)地干姜樣品信息表

OptimaTM2100 DV電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 美國Perkin Elmer公司;HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司;Sartorius BT 125D十萬分之一電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;SAGA-10TY超純水器 南京易普易達科技發(fā)展有限公司;BJ-150高速多功能粉碎機 浙江德清拜杰電器有限公司;D2012高速臺式離心機 大龍興創(chuàng)實驗儀器北京有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液制備 取干姜樣品粉末(過3號篩)0.5 g,精密稱定,置于50 mL塑料離心管中,加濃硝酸7 mL,放置于80 ℃水浴鍋中,消解2 h。待溶液澄清透明或略帶黃色時,消解完畢后,冷卻至室溫,用去離子水定容至50 mL,離心(13000 r/min,10 min),取上清液[28]。

1.2.2 對照品溶液制備 分別取多元素標準溶液,精密量取,用3% HNO3稀釋,配制成適宜濃度的混合標準溶液,見表2。標準溶液中Li、Be、B、Tl、Pb、Na、Mg、Al、P、K、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Sr、Y、Rh、Cd、Sn、Sb、Ba、Tb濃度均為200 μg/L,Bi為400 μg/L,Hg為5 μg/L。隨機選取一個樣品測定其Ge、In等元素的響應(yīng)信號(CPS),選擇信號較低的并且原子質(zhì)量與被測元素接近的元素作為內(nèi)標。最終選擇Ge 74和In 115作為內(nèi)標。

表2 32種無機元素線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

1.2.3 儀器參數(shù) 等離子體射頻功率1100 W,冷卻氣體流量15 L/min,輔助氣流量0.94 mL/min,載氣流量3.0 mL/min,觀測方向為Axial,觀測高度為15 nm,一次讀數(shù)時間為5 s,進樣延時30 s,泵速為15 r/min,樣品提升速度1.0 mL/min,采樣深度8 mm,分析模式采用全定量模式[29-31]。

1.2.4 標準曲線的制備 將標準品溶液逐級稀釋,以3% HNO3為空白溶液,以Ge和In為內(nèi)標,以元素濃度C(μg/L)作為橫坐標(X),信號強度(CPS)作為縱坐標(Y),制作各元素的標準曲線。得到各無機元素的回歸方程如表2所示,其中Li、Be、B、Tl、Pb、Al、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Sr、Y、Rh、Cd、Sn、Sb、Ba、Tb的回歸方程的相關(guān)系數(shù)r>0.999。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將28批干姜樣品的32種無機元素含量作為變量,將測定數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.0軟件,進行主成分分析(PCA)和聚類分析(CA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗 將混合標準溶液,按上述方法連續(xù)重復(fù)測定6次,各元素含量的RSD在1.52%～4.96%,表明儀器精密度良好。

表3 28批不同產(chǎn)地干姜樣品中32種無機元素含量(mg/kg)

續(xù)表

2.1.2 重復(fù)性試驗 平行制備6份供試品溶液,按上述方法測定,各元素含量的RSD在2.46%～3.59%,表明儀器重復(fù)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液,按上述方法測定,分別于0、1、2、4、6、8、12 h測定,各元素含量的RSD<4.59%,表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 加樣回收率試驗 精密稱取樣品S1樣品,分別加入等量S1樣品中各元素含量的對照品,平行3份,按上述方法測定,加樣回收率為96.69%～112.22%,RSD<4.10%,說明該方法準確可靠。

2.2 樣品測定結(jié)果

取28批樣品,照1.2.1項下方法制備供試品溶液,按照1.2.3項下儀器參數(shù)上機測定,結(jié)果見表3。28批干姜樣品中共檢測到32種元素,其中Rh、Tb、Sb未檢出,僅貴州盤縣的樣品檢測出Tl、Sn,其他樣品均未檢測到這兩種元素。干姜中含量較高的元素為K、P、Mg、Na、Mn含量范圍分別為22587.83～92248.51、1778.29～4449.33、1848.98～4293.83、39.72～1216.93、79.16～3864.6 mg/kg。除Mn以外,還含有微量元素Fe(27.84～960.26 mg/kg)、Zn(14.3～55.45 mg/kg)。重金屬元素Pb(0.21～1.93 mg/kg)、Cd(0.02～0.50 mg/kg)、As(<1.01 mg/kg)、Hg(<6.19 mg/kg)、Cu(2.40～7.96 mg/kg)。

2.3 不同產(chǎn)地干姜無機元素分析

2.3.1 聚類分析 在聚類分析譜系圖中,縱坐標為距離,橫坐標為樣品編號,在距離為200時,所有的干姜樣品被劃分為兩類,一類是來自山東省的樣品,另一類是來自四川省、云南省、貴州省的樣品。山東地區(qū)的樣品與其他地區(qū)的樣品無機元素組成差異大,而西南地區(qū)貴州、云南、四川的干姜無機元素組成相似,可能是由于地理環(huán)境的因素影響了干姜中無機元素的積累。

圖1 28批干姜聚類分析譜系圖

2.3.2 主成分分析 兩個主成分的貢獻率分別為PC1=0.903,PC2=0.023,分析發(fā)現(xiàn)來自四川、云南、貴州的樣品較好地聚集為一類,來自山東的樣品聚為一類。因此,四川、云南、貴州地區(qū)所產(chǎn)的干姜在無機元素的組成上較為相似,而山東地區(qū)所產(chǎn)的干姜與它們的差異較大。其中K、Na、P、Mg、Mn是對分類影響較大的幾種變量。上述幾種元素為干姜中含量較高的幾種元素,其含量的變化對分類結(jié)果有較大的影響,主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果具有一致性。

圖2 28批干姜樣品主成分得分圖(A)與Loading-plot圖(B)

2.4 云南干姜無機元素分析

2.4.1 云南干姜無機元素組成分析 根據(jù)干姜藥材的本草考證研究結(jié)果,目前干姜的道地藥材產(chǎn)區(qū)集中在云南的羅平、師宗。四川的犍為、沐川,貴州的六盤水等地,其中以云南地區(qū)為干姜藥材(小黃姜)的主產(chǎn)區(qū)。因此,以云南省樣品的各無機元素含量的平均值作為變量,分析云南省干姜的無機元素組成,所測的32種無機元素,K、P和Mg分別占84.22%、7.01%和6.98%,而Mn、Na、Fe和Al分別占0.70%、0.53%、0.20%和0.20%。

圖3 云南干姜無機元素占比分析

2.4.2 云南未去皮干姜與去皮干姜無機元素含量對比 通過對未去皮干姜樣品(S23、S24、S25)以及去皮的干姜樣品(S26、S27、S28)中的重金屬元素含量對比發(fā)現(xiàn),其中Hg、Pb、As、Cd的含量在去皮樣品中顯著低于未去皮的樣品,Cu含量在干姜去皮之后也呈現(xiàn)下降趨勢。因此,干姜經(jīng)過去皮處理之后,重金屬及有害元素的含量下降,可能與姜皮對重金屬元素的富集作用有關(guān)。目前,在四川犍為、云南等干姜主要產(chǎn)區(qū)同樣發(fā)現(xiàn)去皮之后的干姜中重金屬元素含量顯著降低。而去皮之后干姜中的指標性化學(xué)成分含量與去皮之前并無顯著性差異。去皮后干姜中揮發(fā)油、總酚含量均無顯著變化,且去皮后能夠降低干燥時間,降低干燥過程中的能源消耗,更有利于實際生產(chǎn)[32]。

圖4 云南未去皮干姜與去皮干姜重金屬元素含量比較

3 討論與結(jié)論

28批干姜樣品中,含量相對較高的元素有K、P、Mg、Mn、Na、Fe和Zn,其中以K、P含量最高。K平均含量高達34674 mg/kg,它是維持酸堿平衡,參與能量代謝以及維持神經(jīng)肌肉的正常功能的重要元素;P平均含量高達2721 mg/kg,它是組成生命的重要物質(zhì),參與代謝過程和酸堿平衡的調(diào)節(jié);干姜中同樣含有較多人體所需的微量元素,如Fe、Zn、Mn等,因此干姜的營養(yǎng)價值也較高,具備進一步開發(fā)功能性食品的潛力。

《中國藥典》2015版中對重金屬含量一般要求為[1]:Pb≤5.0 mg/kg、Cd≤0.3 mg/kg、Hg≤0.2 mg/kg、Cu≤20.0 mg/kg、As≤2.0 mg/kg,但對干姜的重金屬含量并無具體限定要求。《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》[15]規(guī)定重金屬總量應(yīng)≤20.0 mg/kg,Cu≤ 20.0 mg/kg,Hg≤0. 2 mg/kg,Pb≤5.0 mg/kg,Cd≤0.3 mg/kg,As≤2.0 mg/kg。結(jié)合測定結(jié)果,Pb(0.21～1.93 mg/kg)、Cd(0.02～0.5 mg/kg)、As(<1.01 mg/kg)、Hg(<6.19 mg/kg)、Cu(2.4～7.96 mg/kg)。根據(jù)上述兩種標準,所有樣品中Pb、As、Cu均符合上述標準,樣品S1～S4、S6～S8、S10、S12、S14～S16、S20～S25、S28中Hg含量超出標準,樣品S1、S6、S9、S20～S25中Cd含量超出標準。干姜藥材在經(jīng)過去皮處理之后,重金屬元素含量顯著降低,各元素含量低于限定標準,能夠增加藥材的合格率。張利敏等[21]采用火焰原子吸收光譜法測定干姜中Cd含量為0.53 mg/kg,蔣云福等[33]采用火焰原子吸收分光光度法測定Cd含量為4.95 mg/kg,說明干姜中Cd元素含量相對較高,可能與西南地區(qū)的土壤具有一定的關(guān)聯(lián)性。Hg含量較高,但波動較大,可能與Hg的記憶效應(yīng)相關(guān),在無任何消除汞記憶效應(yīng)的措施下,0.5 μg/L的Hg即可產(chǎn)生明顯的記憶效應(yīng),且隨著Hg濃度的增加,記憶效應(yīng)不斷增強[34],在實驗過程中并未采取消除Hg記憶效應(yīng)的相關(guān)措施,可能導(dǎo)致樣品測定結(jié)果波動較大。

本試驗利用ICP-AES建立了干姜中32種無機元素的測定方法,分析了干姜中無機元素的組成。相關(guān)結(jié)果可為基于土壤無機元素特征的干姜藥材質(zhì)量溯源及品質(zhì)評價研究提供參考。同時,干姜藥材在產(chǎn)地加工時,進行去皮處理,既有利于降低重金屬及有害元素的含量,也有利于縮短干燥時間,節(jié)約成本,同時也能為干姜的產(chǎn)地加工方式優(yōu)化及食品開發(fā)應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。