上官琨瑤,黃秀秀,宋 庸,張曉婷,潘 斐,劉怡晨,蔣萬里,錢慧琴

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453000)

月季花(Rosae Chinensis Flos)是薔薇科薔薇屬月季(RosachinensisJacq)的干燥花。味甘,性溫,歸肝經(jīng),具有活血調(diào)經(jīng),疏肝解郁之效,臨床上常用于氣滯血瘀,月經(jīng)不調(diào),痛經(jīng),閉經(jīng),胸脅脹痛等病癥的治療[1],亦可用于冠狀動脈性心臟病、頸淋巴結(jié)炎、肺虛咳嗽咯血、產(chǎn)后陰挺等病癥的治療[2]。研究發(fā)現(xiàn),月季花活性成分有黃酮類、酚酸類、芳香油、鞣質(zhì)和色素[3-4]等,其中,以黃酮類化合物中槲皮素及其苷類為其主要活性成分[5-6],具有抗氧化[7-9],抗腫瘤[10-11],抗菌[12],抗衰老[13],提高機體免疫[14]等作用[15-16]。

黃酮類化合物是藥用植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物,不同采收期與其次生代謝產(chǎn)物的積累有密切聯(lián)系[17]。藥材能否發(fā)揮較好的臨床療效以及評價其質(zhì)量的好壞主要取決于其活性成分[18]。目前,薛紫鯨等[19]采用紫外-可見分光光度法測定不同采收期祁艾的總黃酮和總酚酸含量,發(fā)現(xiàn)祁艾在不同采收期內(nèi)黃酮和酚酸的含量有較大的差異,經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)端午節(jié)前后祁艾有效成分含量最高,最終確定祁艾的最佳采收期。此外,付士朋等[20]測定不同采收期芍藥中有效成分含量,并探究其含量與采收期之間的變化規(guī)律。月季花的研究多局限在黃酮含量測定及提取工藝方面,但關(guān)于月季花在不同的采收期其有效成分是否有較大的差異尚未見報道。

本實驗以2019年4月中旬至11月中旬采收的月季花為研究對象,測定不同采收期月季花總黃酮含量,并以其清除DPPH·、羥基自由基的能力來評價其抗氧化活性,探究其總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性,最終確定月季花最佳采收期,為其資源的開發(fā)、臨床應(yīng)用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

月季花 采集于河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院校園內(nèi),經(jīng)閆福林教授鑒定為薔薇科薔薇屬植物月季;蘆丁對照品 純度98%,中國食品藥品檢定研究院;1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH) 東京化成工業(yè)株式會社;L-抗壞血酸(VC) 上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、石油醚、乙酸乙酯 分析純,天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

ME203E/02型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;101-3ES型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;CAA-420型低溫冷卻水循環(huán)泵 鄭州杜甫儀器廠;T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度儀 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 月季花預(yù)處理 將2019年4月中旬-11月中旬(表1)的月季花清洗干凈,晾曬至干燥,粉碎,過60目篩,分別置于密封袋中保存,備用。

表1 月季花樣品信息

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL蘆丁母液 0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL,分別置于10 mL容量瓶中,采用NaNO2-Al(NO3)3法顯色,分別加入5% NaNO20.4 mL,搖勻,6 min后加入10% Al(NO3)30.4 mL,搖勻,6 min后再加入4% NaOH 溶液4 mL,蒸餾水定容至刻度,15 min后于波長510 nm處測定不同濃度蘆丁的吸光度A[21]。以蘆丁濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),在0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)得線性回歸方程y=1.8109x-0.0561,決定系數(shù)R2=0.9998。

1.2.3 供試品溶液的制備 參照錢慧琴等[22]的提取方法制備供試液,精密稱取不同采收期月季花粉末2 g,按液料比42∶1 mL/g加入60%乙醇溶液,于87 ℃下加熱回流提取85 min,過濾,濾液于55 ℃減壓濃縮至無醇味,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯部位減壓濃縮至浸膏,加無水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,定容至刻度,即得月季花供試品溶液。

1.2.4 月季花總黃酮含量的測定 精密吸取不同采收時期月季花供試品溶液1.00 mL,置10 mL容量瓶中,采用NaNO2-Al(NO3)3法顯色,于510 nm處測定月季花供試品溶液的吸光度。不同采收期月季花總黃酮的含量的按式(1)計算。其中,供試品溶液的濃度按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算。

式(1)

式中:Y為月季花總黃酮含量,mg/g;C為月季花總黃酮的質(zhì)量濃度,mg/mL;V為測量總黃酮提取液體積，mL;N為稀釋倍數(shù);M為月季花干品質(zhì)量,g。

1.2.5 月季花不同采收期抗氧化活性評價

1.2.5.1 清除DPPH自由基能力測定 參照閆蕊等[23]的方法并加以修改,將不同采收期月季花供試品溶液配成 2、8、14、20、26、32、40、50 μg/mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液,吸取2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液置于試管中,加入質(zhì)量濃度為2.55×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液(臨用現(xiàn)配)2 mL,搖勻,避光反應(yīng)30 min后于517 nm波長處測其吸光度A1。同時測定2 mL樣品溶液和2 mL無水乙醇的吸光度A2,2 mL無水乙醇和2 mL DPPH乙醇溶液的吸光度A0。以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作為對照組。根據(jù)式(2)計算DPPH·清除率,即:

式(2)

式中,W表示DPPH·清除率,A1表示加入樣品的吸光度,A2表示樣品參比溶液的吸光度,A0表示未加樣品的吸光度。

表2 不同采收期月季花提取物中的總黃酮含量(n=3)

1.2.5.2 清除羥基自由基(OH·)能力測定 參照張春生等[24]的方法并加以修改,配制不同質(zhì)量濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.2、1.5 mg/mL的月季花樣品溶液,依次加入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、不同質(zhì)量濃度的樣品溶液各1 mL,再加入4 mL 20 mmol/L H2O2溶液,搖勻,37 ℃水浴下反應(yīng)30 min,于510 nm處測定吸光度A1;同時測定等體積的去離子水代替H2O2溶液的吸光度A2;測定等體積的乙醇溶液代替樣品溶液的吸光度A0。以相同質(zhì)量濃度的 VC溶液作為對照組。根據(jù)式(3)計算OH·清除率,即:

式(3)

式中,W表示OH·清除率,A1表示加入樣品的吸光度,A2表示樣品參比溶液的吸光度,A0表示未加樣品的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述實驗均重復(fù)三次,運用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 20.0及Excel進行圖表的繪制及數(shù)據(jù)的處理,實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收期月季花中黃酮含量的動態(tài)變化規(guī)律

由表2所示,不同采收期的月季花中總黃酮含量是呈動態(tài)變化的,4月中旬至9月中旬,隨著采收期的延長,月季花中總黃酮的含量呈現(xiàn)下降而又驟然上升的趨勢;9月中旬至11月中旬,月季花總黃酮含量緩慢下降趨于平緩。其中,4月中旬月季花總黃酮含量最高,為(152.28±1.69) mg/g,5月中旬月季花總黃酮含量次之,為(147.11±1.05) mg/g。8月中旬時月季花總黃酮含量最低,為(106.54±2.00) mg/g。一般認(rèn)為黃酮的積累與植物的生長期、溫度和水分有關(guān)[19]。4月總黃酮最高可能因為月季花尚未完全開放,且生長溫度較低,越冬芽發(fā)育的早期幼苗生長較慢,黃酮積累較豐富有關(guān)。8月月季花總黃酮最低可能是由于該時期花已經(jīng)完全開放,且天氣炎熱,降雨量多,作物生長較快,黃酮積累較少有關(guān)。

2.2 不同采收期月季花的抗氧化活性評價

2.2.1 清除DPPH·能力 由圖1可知,在質(zhì)量濃度2～50 μg/mL范圍內(nèi),隨著不同采收期的月季花總黃酮溶液和陽性對照VC質(zhì)量濃度的增大,對DPPH·清除率逐漸增強而趨于平衡。通過SPSS 20.0軟件計算不同采收期月季花總黃酮溶液和VC對DPPH·的半數(shù)清除率IC50,如圖2所示。7月、8月采收的月季花所含總黃酮對DPPH·的半數(shù)清除率(IC50=1.792,2.772 μg/mL)明顯低于VC(IC50=4.806 μg/mL),說明7月、8月采收的月季花所含總黃酮對DPPH·的清除能力高于VC,其中7月份月季花總黃酮對DPPH·清除能力最強。4～6月、9～11月采集月季花的總黃酮對DPPH·的半數(shù)清除率IC50均高于VC,說明此時抗氧化活性均弱于VC。由此可見,不同采收期的月季花總黃酮含量呈現(xiàn)出不同程度的清除DPPH·的能力,表現(xiàn)出不同程度的抗氧化活性,這可能是因為月季花在不同采收期黃酮類成分積累雖存在較大差異,但是黃酮類成分的結(jié)構(gòu)不同,所起到的抗氧化活性不相同[25-26],對月季花的抗氧化活性也有一定程度的影響。

圖1 不同采收期月季花總黃酮對DPPH· 的清除能力

圖2 不同采收期月季花總黃酮對DPPH·的半數(shù)清除率IC50

2.2.2 清除羥基自由基能力 由圖3所示,不同采收期月季花總黃酮對OH·的清除能力隨著樣品和VC質(zhì)量濃度的增加而不斷的增強,體現(xiàn)出顯著的量效關(guān)系。不同采收期月季花總黃酮溶液和VC對OH·的半數(shù)清除率IC50如圖4所示,不同采收期的月季花總黃酮對OH·的半數(shù)清除率均高于VC,說明不同采收期的月季花總黃酮對OH·清除能力均弱于VC,但依然表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。在月季花不同采收期中,7月份月季花總黃酮清除OH·的能力最強,這與上述清除DPPH·的結(jié)果是一致的。

2.3 抗氧化活性與總黃酮含量相關(guān)性分析

由表3可知,不同采收期月季花總黃酮含量與DPPH自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)范圍為0.8000～0.9842,除了11月份呈顯著相關(guān)(P<0.05)外,其他月份均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)(P<0.01);不同采收期月季花總黃酮與OH自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)范圍為0.9639～0.9947,均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)(P<0.01),因此可以推斷月季花總黃酮含量與其抗氧化活性均呈一定的相關(guān)性,總黃酮含量越高,抗氧化活性越高,黃酮的含量是影響月季花抗氧化活性的重要因素。

表3 不同采收期的月季花提取物中總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

圖3 不同采收期月季花總黃酮對OH·的清除能力

圖4 不同采收期月季花總黃酮對OH·的半數(shù)清除率IC50

3 討論與結(jié)論

本研究以不同采收期月季花為研究對象,比較其總黃酮含量和抗氧化活性。結(jié)果表明,月季花總黃酮含量不同的采收期內(nèi)其含量差異很大,其含量變化為:4月份>5月份>9月份>10月份>11月份>6月份>7月份>8月份。4月份采收的月季花總黃酮含量最高,8月份采收的月季花總黃酮含量最低。月季花總黃酮含量表現(xiàn)出明顯的季節(jié)規(guī)律性,在春季和秋季含量比較高,尤其是在春季,含量最高。月季花總黃酮含量的波動主要與其生長周期,生長環(huán)境,采收次數(shù),初采時間,采收間隔時間等[27]因素有關(guān)。這一結(jié)果與薛紫鯨等[19]不同采收期祁艾化學(xué)成分差異性研究結(jié)果相一致。

體外抗氧化活性研究結(jié)果顯示7月份采收的月季花總黃酮清除DPPH自由基和OH自由基的能力最強。相關(guān)性分析結(jié)果表明,月季花總黃酮含量與其抗氧化活性均具顯著相關(guān)性,但是體外抗氧化活性試驗顯示月季花的抗氧化活性與總黃酮含量不是正相關(guān)的。這可能是由于在不同采收期中月季花積累的黃酮的結(jié)構(gòu)不同,發(fā)揮的抗氧化活性有一定差異,另外在提取過程中,若溫度過高會造成黃酮結(jié)構(gòu)的破壞,促進其他雜質(zhì)的溶出,從而影響其抗氧化活性。

綜合考慮,4月份月季花總黃酮含量最高,若此時采摘將影響月季的生長,且抗氧化試驗表明4月的抗氧化活性并不是最高的。7月份采摘月季花其抗氧化活性最高,藥用價值較高,故以7月份采摘月季花的最佳時期。另外相關(guān)性分析顯示,月季花總黃酮是其抗氧化的主要活性成分,但其具體的黃酮物質(zhì)的組成和含量以及其他雜質(zhì)對于抗氧化活性關(guān)系仍需進一步分析和完善。