劉玉琪,李鴻梅,范春婷,閔偉紅,高雅文

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118)

重金屬造成的水污染是近年來(lái)最大的環(huán)境問(wèn)題之一,土壤、農(nóng)業(yè)用水的重金屬污染尤為嚴(yán)重[1],它們可以積聚在動(dòng)植物體內(nèi),通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體,對(duì)健康造成巨大的危害[2-3]。銅和鎘是廢水中最常見(jiàn)的兩種重金屬[4]。雖然銅是人體必需元素,但在體內(nèi)過(guò)量積累也會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的毒理學(xué)問(wèn)題,如嘔吐、痙攣、抽搐,甚至死亡[5]。鎘是目前廢水中發(fā)現(xiàn)毒性最大的重金屬,會(huì)對(duì)呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)造成危害[6-7],也可導(dǎo)致骨骼軟化、肝中毒、肺癌等[8]。因此去除廢水中的重金屬成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn),目前去除銅、鎘的方法有化學(xué)沉淀、離子交換、生物吸附、膜過(guò)濾、電化學(xué)處理等[9-13],其中生物吸附是一種新型有效且經(jīng)濟(jì)環(huán)保的方法,受到眾多學(xué)者關(guān)注[14]。

羅耳阿太菌多糖(Atheliarolfsiipolysaccharide,AEPS)是一種生物吸附劑,國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明,生物吸附可能是由靜電吸附、絡(luò)合、離子交換、表面沉淀[15]等引起的。2015年侯文潔[16]從苜蓿中華根瘤菌株中分離出胞外聚合物,發(fā)現(xiàn)銅離子主要以離子交換方式結(jié)合在胞外聚合物上。2018年Adam等[17]報(bào)道了從牛肝菌子實(shí)體中分離出堿性多糖,并通過(guò)吸附鉛和鎘離子試驗(yàn)證實(shí)了這種多糖具有良好的生物吸附能力。同年田月月等[18]研究了水溶性大豆多糖對(duì)鉛離子的吸附,并通過(guò)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)推測(cè)大豆多糖分子鏈的羧基是與鉛離子吸附的主要基團(tuán)。

本研究旨在采用正交試驗(yàn)優(yōu)化AEPS吸附銅離子和鎘離子,并通過(guò)掃描電子顯微鏡和X射線能譜儀及紅外光譜初步揭示AEPS吸附銅離子和鎘離子機(jī)理,為AEPS處理重金屬污染的食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)用水的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅耳阿太菌 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提供;氯化鈉、五水硫酸銅、四水硝酸鎘、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚 均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?SephacrylTM S-400 High Resolution柱料 GE公司;超濾離心管(3000 Da) 美國(guó)Millipore公司。

電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;UV-1700紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀、AA-6300原子吸收分光光度計(jì) 日本島津公司;低溫高速離心機(jī) 德國(guó)HERMLE公司;FD-1B-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;掃描電子顯微鏡、X-射線能譜儀 COXEM公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液:將3.9281 g CuSO4·5H2O溶于少量去離子水中,待完全溶解后,用容量瓶定容至1 L,得到Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 g/L),試驗(yàn)中逐級(jí)稀釋使用。

Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液:將2.7442 g Cd(NO3)2·4H2O溶于少量去離子水中,待完全溶解后,用容量瓶定容至1 L,得到Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 g/L),試驗(yàn)中逐級(jí)稀釋使用。

1.2.2 羅耳阿太菌粗AEPS的提取與純化 羅耳阿太菌發(fā)酵培養(yǎng)后,取發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH至7～8,恒溫80 ℃水浴30 min,冷卻后4 ℃,8000 r/min離心5 min,上清液木瓜蛋白酶法除蛋白后醇沉,透析后冷凍干燥,得到粗AEPS粉備用[19]。

采用Sephacryl S400-HR柱料進(jìn)行純化,AEPS濃度1.5 g/L,上樣量5 mL,以0.9%(w/w)氯化鈉溶液洗脫5 h,流速0.5 mL/min。采用苯酚-硫酸法隔管檢測(cè)AEPS含量,收集純化后AEPS,濃縮透析冷凍干燥后用于后續(xù)分析[20]。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 pH對(duì)Cu2+和Cd2+吸附率的影響 Cu2+和Cd2+溶液濃度為0.2 g/L(用標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋得到),將AEPS溶液與等體積的重金屬離子溶液混勻,AEPS濃度為1.5 g/L,調(diào)節(jié)Cu2+溶液pH(1、2、3、4、5),Cd2+溶液pH(1、2、3、4、5、6、7、8),30 ℃反應(yīng)60 min,反應(yīng)結(jié)束后,置于超濾離心管中4500 r/min離心30 min,取上清液稀釋100倍后,采用火焰原子吸收法測(cè)定Cu2+和Cd2+殘留量,每組樣品3次平行。

1.2.3.2 AEPS初始濃度對(duì)Cu2+和Cd2+吸附率的影響 其他條件不變,Cu2+溶液pH為4,Cd2+溶液pH為6,AEPS溶液濃度分別為0.5、1、1.5、2、2.5 g/L,30 ℃反應(yīng)60 min,每組樣品3次平行。

1.2.3.3 吸附溫度對(duì)Cu2+和Cd2+吸附率的影響 其他條件不變,AEPS濃度為1.5 g/L,Cu2+溶液pH為4,Cd2+溶液pH為6,在不同溫度下(20、30、40、50、60 ℃)反應(yīng)60 min,每組樣品3次平行。

1.2.3.4 吸附時(shí)間對(duì)Cu2+和Cd2+吸附率的影響 其他條件不變,AEPS濃度為1.5 g/L,Cu2+溶液pH為4,Cd2+溶液pH為6,40 ℃反應(yīng)15、30、45、60、75、90 min,每組樣品3次平行。

1.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取pH、AEPS濃度、溫度、吸附時(shí)間為自變量，以Cu2+和Cd2+吸附率為因變量,進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定AEPS吸附Cu2+和Cd2+的最優(yōu)工藝條件。

表1 AEPS吸附Cu2+正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 AEPS吸附Cd2+正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5 吸附率的測(cè)定 銅離子和鎘離子殘留量采用《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》中直接吸入火焰原子吸收法檢測(cè),吸附率按照以下公式進(jìn)行計(jì)算。

式中:Y為重金屬離子吸附率,%;Ci為混合液中重金屬離子的初始濃度,g/L;Cf為混合液中重金屬離子的平衡濃度,g/L。

1.2.6 SEM和EDS分析 用導(dǎo)電膠粘合劑固定好吸附前后的AEPS,鍍上金粉,利用掃描電子顯微鏡和X-射線能譜分析儀對(duì)樣品進(jìn)行掃描觀察[21]。

1.2.7 紅外光譜分析 KBr于150 ℃烘箱中干燥4 h,稱取1 mg吸附Cu2+和Cd2+前后的AEPS樣品分別與100 mg干燥后的KBr混合。將混合物精細(xì)研磨然后壓片。選定波長(zhǎng)范圍在4000～400 cm-1,分辨率為4 cm-1,光闌設(shè)置8 mm,描時(shí)間16 s,測(cè)紅外光譜[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 AEPS的純化

如圖1所示,AEPS經(jīng)過(guò)Sephacryl S400-HR分離純化后,獲得兩個(gè)不同組分AEPSⅠ和AEPSⅡ,兩個(gè)組分呈現(xiàn)單一、尖銳、對(duì)稱峰型,且沒(méi)有拖尾現(xiàn)象,說(shuō)明兩個(gè)組分較為專一。收集兩個(gè)組分多糖用于后續(xù)分析。

圖1 Sephacryl S400-HR洗脫曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 pH對(duì)Cu2+和Cd2+吸附率的影響

2.2.2 AEPS初始濃度對(duì)Cu2+和Cd2+吸附率的影響 由圖3可知,當(dāng)AEPS初始濃度在0.5～1.5 g/L時(shí),Cu2+和Cd2+吸附率隨著AEPS初始濃度的增加而增大,AEPS初始濃度在1.5 g/L時(shí)達(dá)到最大值,Cu2+為84.0%,Cd2+為75.52%,隨著AEPS初始濃度的繼續(xù)增大,Cu2+和Cd2+吸附率緩慢下降。AEPS初始濃度也是影響重金屬離子吸附的另一個(gè)重要條件,當(dāng)AEPS濃度過(guò)低時(shí),不能提供足夠的供金屬離子結(jié)合的位點(diǎn),當(dāng)濃度過(guò)高時(shí),AEPS提供的吸附位點(diǎn)過(guò)飽和,但結(jié)合的重金屬離子不穩(wěn)定,而且吸附劑單位質(zhì)量吸附的重金屬離子減少[29],導(dǎo)致吸附率略有下降。因此,選擇AEPS初始濃度1.3、1.5、1.7 g/L為Cu2+和Cd2+吸附正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖3 AEPS初始濃度對(duì)Cu2+和Cd2+吸附率的影響

2.2.3 吸附溫度對(duì)Cu2+和Cd2+吸附率的影響結(jié)果 由圖4可知,當(dāng)吸附溫度在20～40 ℃時(shí),Cu2+和Cd2+吸附率隨著吸附溫度的升高而增大,吸附溫度在40 ℃時(shí)達(dá)到最大值,Cu2+吸附率為86.72%,Cd2+吸附率為75.31%,隨著吸附溫度的繼續(xù)升高,Cu2+和Cd2+吸附率緩慢下降。這可能是由于溫度的升高使AEPS分子中部分官能團(tuán)的鍵發(fā)生斷裂,AEPS的分子活性增強(qiáng),重金屬離子之間的分子動(dòng)能增加,吸附率升高。但溫度過(guò)高,AEPS生物活性會(huì)減弱,吸附率下降[30]。因此,選擇反應(yīng)溫度35、40、45 ℃為Cu2+和Cd2+吸附正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖4 吸附溫度對(duì)Cu2+和Cd2+吸附率的影響

2.2.4 吸附時(shí)間對(duì)Cu2+和Cd2+吸附率的影響結(jié)果 由圖5可知,當(dāng)吸附時(shí)間在0～45 min時(shí),Cu2+吸附率隨著吸附時(shí)間的增大而增大,吸附時(shí)間在45 min時(shí)達(dá)到最大值85.24%,隨著吸附時(shí)間的繼續(xù)增大,Cu2+吸附率輕微下降;當(dāng)吸附時(shí)間在0～60 min時(shí),Cd2+吸附率隨著吸附時(shí)間的增大而增大,吸附時(shí)間在60 min時(shí)達(dá)到最大值75.09%,隨著吸附時(shí)間的繼續(xù)增大,Cd2+吸附率緩慢下降。因此,選擇時(shí)間40、45、50 min為Cu2+吸附正交試驗(yàn)的三個(gè)水平,選擇時(shí)間55、60、65 min為Cd2+吸附正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖5 吸附時(shí)間對(duì)Cu2+和Cd2+吸附率的影響

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化

如表3所示,通過(guò)極差分析可知A、B、C、D四個(gè)因素影響AEPS吸附Cu2+的主次順序是B>A>D>C,即AEPS初始濃度>pH>吸附時(shí)間>吸附溫度。由表4可知,AEPS初始濃度、pH和吸附時(shí)間對(duì)Cu2+吸附有極顯著(P<0.01)影響,最佳吸附條件為A3B2C2D2,取最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),AEPS吸附率為88.27%,即pH4.5,AEPS濃度1.5 g/L,吸附溫度40 ℃,吸附時(shí)間45 min,最佳吸附率為88.27%。

表3 AEPS吸附Cu2+正交試驗(yàn)優(yōu)化

表4 AEPS吸附Cu2+正交試驗(yàn)方差分析表

如表5所示,通過(guò)極差分析可知A、B、C、D四個(gè)因素影響AEPS吸附Cd2+的主次順序是B>A>D>C,即AEPS初始濃度>pH>吸附時(shí)間>吸附溫度。由表6可知,AEPS初始濃度和pH對(duì)Cd2+吸附有極顯著(P<0.01)影響,吸附時(shí)間對(duì)Cd2+吸附有顯著(P<0.05)影響,最佳吸附條件為A3B2C3D2,取最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),AEPS吸附率為77.81%,即pH6.5,AEPS濃度1.5 g/L,吸附溫度45 ℃,吸附時(shí)間60 min,此時(shí)對(duì)應(yīng)的吸附率為77.81%。由AEPS對(duì)Cu2+和Cd2+的吸附最優(yōu)條件中可以看出,對(duì)兩種重金屬離子吸附影響因素最主要的是吸附pH不同,在Cu2+的最優(yōu)條件下Cd2+也有吸附效果,但在Cd2+的最優(yōu)條件下pH為6.5,在此pH下Cu2+會(huì)產(chǎn)生沉淀。因此若對(duì)溶液中同時(shí)存在Cu2+和Cd2+時(shí),可以采用先在Cu2+的最優(yōu)條件下吸附Cu2+,使Cu2+的吸附率達(dá)到最高,然后調(diào)整溶液pH,溫度等條件以達(dá)到Cd2+的最優(yōu)條件,在此條件下吸附Cd2+。

表5 AEPS吸附Cd2+正交試驗(yàn)優(yōu)化

表6 AEPS吸附Cd2+正交試驗(yàn)方差分析表

2.4 外貌觀察

如圖6所示,經(jīng)過(guò)真空凍干后,AEPS吸附重金屬離子前后外貌存在明顯差異,A為AEPS,凍干后為淡黃色絮狀物質(zhì),結(jié)構(gòu)緊密;B為AEPS-Cu,凍干后結(jié)構(gòu)松散,呈顆粒和碎片狀,顏色略微偏藍(lán)；C為AEPS-Cd，凍干后狀態(tài)和AEPS-Cu相似,顏色較AEPS偏淺。

圖6 AEPS、AEPS-Cu和AEPS-Cd外貌觀察

2.5 掃描電子顯微鏡分析

如圖7所示,圖7A～圖7F顯示了AEPS、AEPS-Cu和AEPS-Cd在掃描電子顯微鏡下的表面形態(tài),吸附前(圖7A、圖7B),AEPS結(jié)構(gòu)以薄片為主,伴有一些碎片狀和桿狀形態(tài),并且表面平整無(wú)其他物質(zhì)存在。吸附Cu2+和Cd2+后(圖7C～圖7F),AEPS表面不平整,以碎片狀和桿狀為主,這和吸附后(圖6)外貌觀察結(jié)果一致,在5000倍放大倍數(shù)下觀察,發(fā)現(xiàn)AEPS表面變粗糙,明顯看到有其他物質(zhì)存在,這可能是因?yàn)镃u2+和Cd2+吸附于AEPS表面,導(dǎo)致表面結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖7 AEPS、AEPS-Cu和AEPS-Cd的SEM觀察

2.6 X-射線能譜分析

對(duì)AEPS、AEPS-Cu和AEPS-Cd進(jìn)行EDS觀察,結(jié)果如圖8～圖10所示,由圖8可知,AEPS吸附金屬離子前,AEPS中主要元素為C、N、O,還有少數(shù)Na、Mg、P、S、Cl存在,這可能是由于在羅耳阿太菌發(fā)酵過(guò)程中,發(fā)酵培養(yǎng)基中含有檸檬酸、MgSO4·7H2O、KCl,AEPS在發(fā)酵和提取過(guò)程中吸附了這些離子。由圖9、圖10可知,AEPS吸附Cu2+后,譜圖中出現(xiàn)了之前沒(méi)有的Cu和Cd元素,說(shuō)明AEPS成功吸附了Cu2+和Cd2+,根據(jù)能譜峰強(qiáng)度來(lái)看,AEPS、AEPS-Cu和AEPS-Cd各個(gè)元素含量都不一樣,這可能是由于EDS結(jié)果取決于AEPS的孔隙率和表面均勻性[31],并且由峰的面積可知,AEPS吸附Cu2+的能力大于Cd2+的能力,除了pH、多糖濃度等影響因素外,還可能是因?yàn)镃d2+的原子半徑比Cu2+的大,Cu2+更有利于AEPS的吸附[32],該結(jié)果與AEPS-Cu和AEPS-Cd的單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果相吻合。

圖8 AEPS X射線能譜儀分析

圖9 AEPS-Cu X射線能譜儀分析

圖10 AEPS-Cd X射線能譜儀分析

2.7 紅外光譜分析

AEPS吸附Cu2+和Cd2+前后的紅外光譜如圖11所示,多糖具有典型的特征吸收峰,對(duì)于AEPS,3392.63 cm-1處的吸收峰是O-H的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的,這是多糖的主要官能團(tuán),2929.74 cm-1處的吸收峰是C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰,AEPS吸附Cu2+和Cd2+后,O-H的吸收峰分別移動(dòng)至3398.42和3388.71 cm-1,C-H的吸收峰移動(dòng)至2933.67 cm-1,這可能是由于吸附作用,Cu2+和Cd2+取代了官能團(tuán)中的H所導(dǎo)致;1240.17 cm-1處的吸收峰是C-H變角振動(dòng)引起的吸收峰,由圖譜可以看出AEPS-Cu和AEPS-Cd在此處的峰明顯增強(qiáng);1080.09 cm-1處的吸收峰是由兩種C-O伸縮振動(dòng)引起的吸收峰,AEPS-Cu移動(dòng)至1112.88 cm-1,且峰型明顯變寬,AEPS-Cd移動(dòng)至1078.16 cm-1,峰型與AEPS-Cu相比較窄,說(shuō)明AEPS吸附Cu2+能力強(qiáng)于Cd2+;900～800 cm-1處的吸收峰是β型C-H變角振動(dòng)的特征吸收峰,這與AEPS是β型葡聚糖結(jié)論一致[33],且吸附金屬離子后,該吸收峰都明顯增強(qiáng);600～400 cm-1處的吸收峰主要是CCO變形振動(dòng)吸收峰,由圖11可以看出,AEPS在468.68 cm-1有吸收峰,而在AEPS-Cu和AEPS-Cd譜圖中消失了,這可能是由于金屬離子的加入將其雙鍵結(jié)構(gòu)打破導(dǎo)致的。通過(guò)FTIR分析可以發(fā)現(xiàn),AEPS中的羥基、羧基等官能團(tuán)參與了反應(yīng)。Liu[34]報(bào)道多糖吸重金屬離子的主要機(jī)理是通過(guò)羥基、羧基和酰胺基團(tuán)的絡(luò)合反應(yīng),Wei等[35]研究發(fā)現(xiàn),羧酸中的羰基、酚類碳?xì)滏I和酰胺基團(tuán)的拉伸和振動(dòng)在重金屬吸附中起著重要作用,而Dang等[36]則發(fā)現(xiàn)羧基基團(tuán)的去質(zhì)子化形式的靜電吸附和非離子化羥基與重金屬離子的絡(luò)合作用也是一種重要的吸附機(jī)理。推測(cè)AEPS吸附Cu2+和Cd2+的主要機(jī)理是Cu2+和Cd2+取代了O-H和C-H官能團(tuán)中的H+,并與C-O官能團(tuán)發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng),同時(shí)打破了CCO官能團(tuán)中的雙鍵,這些反應(yīng)的發(fā)生使得AEPS能夠很好地吸附Cu2+和Cd2+。

圖11 AEPS、AEPS-Cu和AEPS-Cd紅外光譜分析

3 結(jié)論

AEPS吸附Cu2+最優(yōu)工藝為pH4.5,AEPS濃度1.5 g/L,吸附溫度40 ℃,吸附時(shí)間45 min,吸附率為88.27%;AEPS吸附Cd2+最優(yōu)工藝為pH6.5,多糖濃度1.5 g/L,吸附溫度45 ℃,吸附時(shí)間60 min,吸附率為77.81%。掃描電子顯微鏡和X射線能譜儀結(jié)果表明,AEPS為薄片和桿狀結(jié)構(gòu),吸附Cu2+和Cd2+后表面變粗糙,以桿狀和碎片為主,并在能譜圖中出現(xiàn)Cu和Cd元素峰。紅外光譜結(jié)果表明,AEPS中的O-H、C-H、C-O和CCO官能團(tuán)和Cu2+、Cd2+之間產(chǎn)生靜電吸附和絡(luò)合作用,是吸附反應(yīng)的關(guān)鍵基團(tuán)。本文研究的結(jié)果,為AEPS處理重金屬污染的食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)用水提供了可參考的理論依據(jù)。