王 玉,劉 琦,耿 杰

(南昌理工學(xué)院,江西南昌 330044)

沙棘果屬于胡頹子科沙棘屬植物沙棘(HippophaerhamnoidesL.)的果實,含有多種維生素、氨基酸、類固醇及黃酮類化合物等營養(yǎng)成分,由于其保健效果和藥用價值較高,常用于保健食品的添加[1-2]。有研究表明沙棘黃酮不僅能夠改善體內(nèi)血脂異常,還可增強機體免疫功能,具有較好的體外抗氧化活性[3-4],然而對其體內(nèi)的抗疲勞作用研究卻鮮有報道。

目前,雖常用有機溶劑、酶、超聲波、微波等方法提取沙棘果黃酮化合物[5-7],但產(chǎn)物一般純度較低,雜質(zhì)較多,可能影響產(chǎn)物的生物活性。大孔樹脂吸附分離天然產(chǎn)物,是利用樹脂具有機械篩分與化學(xué)吸附的特性,選擇性高、干擾因素少、并可再生利用,因此被廣泛用于天然成分的分離與純化[8-9]。雖然大孔樹脂純化沙棘黃酮早有文獻報道[10-11],但研究對象多為沙棘葉和籽,僅有焦巖等采用X-5型大孔樹脂研究沙棘果渣總黃酮的純化工藝[12],但該研究工藝的純化效率一般,且未對樹脂的吸附機理進行深入探討。

本研究基于超聲提取沙棘果中黃酮類化合物的研究基礎(chǔ)上,利用相關(guān)模型和吸附-洗脫實驗,討論該粗提物的最佳純化工藝條件,考察其體內(nèi)抗運動性疲勞的作用效果,進而為相關(guān)食品的開發(fā)提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘果 山西大同采收的成熟新鮮果實;西洋參 江西昌盛大藥房;蘆丁對照品(UV>92.4%) 中國藥品生物制品檢定研究院;無水乙醇、鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 均為分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;乳酸、乳酸脫氫酶、肌糖原、肝糖原濃度檢測試劑盒 南京信帆生物有限公司;試驗用水為純化水;健康雄性小鼠 100只,體質(zhì)量15～22 g 江西省實驗動物中心提供(許可證號:SYXK 2018-0006),生長環(huán)境溫度20～25 ℃,相對濕度50%～70%;AB-8、H-103、D-101大孔樹脂 天津西金納環(huán)保材料科技有限公司;HPD 400、HPD 600大孔樹脂 河北寶恩化工有限公司。

Y-W2型超威粉碎機 濰坊星爾機械設(shè)備有限公司;721型紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;JY96-II型超聲波細(xì)胞粉碎機 上海熙揚儀器有限公司;ME104型電子天平 梅特勒-托利多公司;PR-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 普瑞科技有限公司;VFD-1000A型冷凍干燥箱 上海舜制儀器制造有限公司;TD4型高速離心機 鹽城凱特實驗儀器有限公司;ZWY-110X50型恒溫振蕩器 北京海天友誠科技有限公司;動物恒溫游泳池 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮粗提物制備 參照文獻方法[6],取沙棘黃酮果干燥后,完全粉碎,過60目篩,準(zhǔn)確稱取20 g樣品置于500 mL 50%乙醇溶液內(nèi),于400 W功率超聲波下提取20 min,離心后的上清液經(jīng)濃縮、冷凍干燥后,得到總黃酮粗品,備用。

1.2.2 黃酮含量的測定 參照文獻方法[13],以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如下:y=1.025x+0.0227(R2=0.9991),同時于510 nm波長下測定樣品的吸光度值,平行測定五次,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,得到樣品溶液中黃酮質(zhì)量濃度,通過下式計算樣品純度。

式(1)

式中:m0為粗提物質(zhì)量,mg;c為產(chǎn)物的黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL;V為樣品溶液體積,mL;D為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 樹脂型號選擇 以無水乙醇作溶劑,配制3 mg/mL 70 mL提取液向裝有置于錐形瓶后,分別加入5.0 g預(yù)處理后[14]的不同類型大孔樹脂(D-101、H-103、AB-8、HPD 400、HPD 600),于室溫靜態(tài)吸附12 h后過濾,測得濾液的總黃酮濃度,通過下式得到不同樹脂的吸附率[15]。

式(2)

式中:Qe為飽和吸附率,%;m0為提取液中總黃酮質(zhì)量,mg;me為飽和吸附后濾液中總黃酮質(zhì)量,mg。

100 mL 70%乙醇溶液準(zhǔn)確加入至裝有飽和吸附樹脂的錐形瓶內(nèi),于室溫靜態(tài)洗脫12 h后過濾,測定濾液中總黃酮濃度,通過下式計算不同樹脂的洗脫率與回收率[15]。

式(3)

式(4)

式中:me為飽和吸附后濾液中總黃酮質(zhì)量,mg;m0為提取液中總黃酮質(zhì)量,mg;md為洗脫液中總黃酮質(zhì)量,mg;R為回收率,%;Dd為洗脫率,%。

1.2.4 等溫吸附試驗 準(zhǔn)確配制50 mL濃度為1、2、3、4、5 mg/mL的沙棘黃酮提取液分別加入至裝有5.0 g D101樹脂的錐形瓶后,置于25、35、45 ℃飽和振蕩吸附,測得平衡吸附量后,繪制D101樹脂的吸附等溫線,同時采用Langmuir、Freundlich吸附模型,擬合相應(yīng)等溫吸附方程[16]。

式(5)

式(6)

式中:Qm為黃酮飽和吸附量,mg/g;Qe為黃酮吸附量,mg/g;Kb為Langmuir方程常數(shù);Ce為濾液黃酮濃度,mg/mL;Kf為Freundlich方程常數(shù)。

1.2.5 吸附動力學(xué) 2 mg/mL 50 mL黃酮提取液加入至裝有5.0 g D101大孔樹脂的錐形瓶內(nèi),分別于室溫下振蕩吸附0.5、1、2、3、4、6、8 h后檢測總黃酮濃度,并根據(jù)不同動力學(xué)模型,繪制樹脂的吸附動力學(xué)曲線,具體如下:

In(Qe-Qt)=In Qe-K1t

式(7)

式(8)

式中:Qe為黃酮飽和吸附量,mg/g;Qt為不同吸附時間的黃酮吸附量,mg/g;t為吸附時間,h;K1為準(zhǔn)一級速率常數(shù),min-1;K2為準(zhǔn)二級速率常數(shù),g·mg-1·min-1。

表1 五種樹脂的靜態(tài)吸附-洗脫性能

1.2.6 動態(tài)吸附與洗脫條件考察

1.2.6.1 不同吸附工藝條件研究 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,以上樣液的質(zhì)量濃度、體積、pH及上樣流速為單因素,分別考察各自對吸附率影響,具體如下:a.固定上樣液pH為5.0,上樣流速為1 mL/min,上樣液體積為70 mL,上樣液質(zhì)量濃度分別為:1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL;b.固定上樣液質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL,上樣流速為1 mL/min,上樣液體積為70 mL,上樣液pH分別為:3.0、4.0、5.0、6.0、7.0;c.固定上樣液質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL,上樣液pH為5.0,上樣液體積為70 mL,考察不同上樣流速(0.5、1、2 mL/min)的樹脂泄漏曲線。

1.2.6.2 不同洗脫工藝條件研究 以乙醇溶液作洗脫劑,分別考察洗脫液濃度、洗脫流速和洗脫液體積對洗脫率的影響,具體如下:a.當(dāng)洗脫流速為1 mL/min,洗脫液體積為160 mL時,洗脫液濃度分別為:50%、60%、70%、80%、90%;b.當(dāng)洗脫液濃度為70%時,考察0.5、1、2 mL/min流速的樹脂洗脫曲線。

1.2.7 體內(nèi)抗運動性疲勞作用 100只健康雄性小鼠,隨機分為五組,每組20只,空白對照組按照0.20 mg/g用量(以體質(zhì)量計,下同),灌胃生理鹽水,陽性對照組采用0.10 mg/g西洋參灌胃,低、中、高劑量組則參考相應(yīng)文獻設(shè)計方法[17-18],依次灌胃0.05、0.10、0.20 mg/g 純化產(chǎn)物,每天灌胃1次,連續(xù)灌胃30 d,灌胃期間各組小鼠喂食與飲水量一致。

最后一次灌胃結(jié)束1 h后,各組隨機選取10只小鼠,于鼠尾負(fù)重5%體重重物,開展負(fù)重游泳試驗,記錄小鼠自入水開始游泳至沉沒超過10 s的時間,即為動物負(fù)重游泳時間[19]。同時,末次灌胃結(jié)束1 h后,各組剩余小鼠于相同游泳時間結(jié)束后,休息10 min,摘取眼球,抽血離心,收集血清,同時分取肝與肌肉組織,利用乳酸、乳酸脫氫酶、肌糖原和肝糖原濃度檢測試劑盒,分別測得運動后不同組別小鼠肝臟中肝糖原含量、肌肉中肌糖原含量、血清中乳酸含量及乳酸脫氫酶的活力[20]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

相關(guān)評價指標(biāo)均采用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差描述,利用SPSS 19.0進行方差分析,檢驗水準(zhǔn)α=0.05,當(dāng)P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂靜態(tài)吸附與洗脫性能比較

不同類型大孔樹脂的樹脂孔徑和極性性質(zhì)差別較大,為此分別比較各自對沙棘黃酮的靜態(tài)吸附-洗脫效果,結(jié)果見表1。從表1可見,五種樹脂對沙棘黃酮的吸附能力不同,其中D101大孔樹脂的吸附效果最佳,吸附率達到89.25%,其次為H103,而飽和吸附于D101大孔樹脂的黃酮也易于在乙醇溶液中解吸,表明D101大孔樹脂對黃酮具有較好的吸附與解吸性能,這可能歸因于黃酮類化合物極性較弱,而D101大孔樹脂為非極性樹脂,與其相互作用較好,因此確定D101大孔樹脂為沙棘黃酮的純化樹脂。

2.2 吸附等溫線

不同溫度下D101大孔樹脂對沙棘黃酮的吸附等溫線,見圖1所示,隨著溶液中黃酮濃度的增大,樹脂吸附量不斷增加,但隨著溫度的升高,平衡吸附量逐漸減少,表明該吸附過程為物理吸附,溫度較高將不利于有效吸附,分別采用不同的等溫吸附方程擬合不同溫度的吸附等溫線,結(jié)果見表2。從表2可知,不同溫度下D101大孔樹脂對沙棘黃酮的等溫吸附過程符合Langmuir吸附等溫模型特征,方程相關(guān)系數(shù)r均大于0.98。

圖1 不同溫度的吸附等溫曲線

表2 不同溫度的吸附等溫線擬合方程

2.3 吸附動力曲線

圖2為D101大孔樹脂吸附沙棘黃酮的動力學(xué)曲線,從圖2可知,吸附4 h后樹脂的吸附量基本達到飽和,靜態(tài)吸附率為89.25%,分別利用相關(guān)動力學(xué)方程模型擬合上述吸附過程,結(jié)果見表3。該吸附過程符合準(zhǔn)一級動力學(xué)模型特征(r>0.98)。吸附速率一般主要由液膜擴散和顆粒內(nèi)擴散共同控制,而從表3可知,In(Qe-Qt)與t線性關(guān)系良好,表明D101大孔樹脂吸附沙棘黃酮的速率主要由顆粒內(nèi)擴散控制。

圖2 吸附動力學(xué)曲線

表3 吸附動力學(xué)擬合方程

2.4 吸附工藝條件考察

2.4.1 上樣液質(zhì)量濃度對吸附率影響 不同上樣液質(zhì)量濃度對吸附率的影響見圖3所示。當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度大于3 mg/mL時,吸附率開始下降,這歸因于黃酮濃度過大,部分化合物未被完全吸附,易堵塞樹脂,而濃度過小,樹脂的使用效率較低,因此確定最佳上樣液質(zhì)量濃度為3 mg/mL。

圖3 上樣液濃度對吸附率的影響

2.4.2 上樣液pH對吸附率影響 由于上樣液pH影響黃酮化合物在溶液中存在形式,進而影響樹脂的吸附效率,因此考察不同上樣液pH對吸附率的影響,結(jié)果見圖4。隨著上樣液pH的增大,黃酮的吸附率先升高后降低,這歸因于黃酮結(jié)構(gòu)中存在大量酚羥基,呈弱酸性,若溶液酸度過高,易形成“徉鹽”,酸度過低,則以離子態(tài)出現(xiàn),均不利于樹脂吸附,因此確定最佳上樣液pH為5.0。

圖4 上樣液pH對吸附率的影響

2.4.3 不同上樣流速的樹脂吸附泄漏曲線 流出液中目標(biāo)化合物的濃度為10%上樣液質(zhì)量濃度,稱為樹脂的吸附泄漏點,在動態(tài)吸附中,若上樣流速過快且上樣液體積過大,目標(biāo)化合物與樹脂接觸并不充分,并可能出現(xiàn)樹脂的過載泄漏,但流速過慢,又影響純化效率,因此考察不同上樣流速下的樹脂泄漏曲線,結(jié)果見圖5。從圖5可知,上樣流速為0.5 mL/min時樹脂的飽和吸附量最大,隨著流速繼續(xù)增大,樹脂吸附泄漏點的上樣液體積不斷降低,綜合考慮吸附效率,確定上樣流速為1 mL/min,上樣液體積為70 mL。

圖5 不同上樣流速的樹脂吸附泄漏曲線

2.5 洗脫工藝條件考察

2.5.1 洗脫液濃度對洗脫率影響 洗脫液濃度影響乙醇溶液的極性,進而影響其與樹脂吸附的目標(biāo)化合物作用效果,因此考察不同洗脫液濃度對洗脫率的影響,結(jié)果見圖6。從圖6可知,隨著乙醇濃度的增大,目標(biāo)化合物的洗脫率不斷升高,至乙醇濃度為70%時下降,這歸因于黃酮類化合物呈弱極性,70%乙醇溶液的極性較低,氫鍵相互作用力較好,因此確定最佳洗脫液乙醇的濃度為70%。

圖6 洗脫液濃度對洗脫率的影響

2.5.2 不同洗脫流速的樹脂洗脫曲線 圖7為不同洗脫流速下飽和吸附后的D101樹脂洗脫曲線,當(dāng)70%乙醇以1 mL/min流速洗脫時,得到的洗脫曲線單一、對稱、尖銳且無明顯拖尾,隨著洗脫流速的增大,曲線峰型逐漸變寬,流速減小又有明顯拖尾,因此確定最佳洗脫流速為1 mL/min,洗脫液體積為160 mL。

圖7 不同洗脫流速的樹脂洗脫曲線

表5 沙棘黃酮對部分生化指標(biāo)的影響

2.6 最佳純化工藝驗證

按照確定的最佳純化工藝,即配制體積為70 mL,pH為5.0,質(zhì)量濃度為3 mg/mL粗提物溶液,以1 mL/min流速,上樣至D101大孔樹脂飽和吸附后,采用160 mL 70%乙醇溶液,以1 mL/min流速洗脫,測得吸附率與洗脫率分別為88.15%和90.05%,產(chǎn)物的總黃酮含量由純化前18.25%±0.86%提高至純化后59.07%±1.82%,約為純化前3.2倍,馮靖等[21]采用大孔樹脂純化銀杏樹葉中總黃酮,產(chǎn)物含量約為純化前3.1倍,而李玉娟等[22]采用大孔樹脂純化瑪咖總黃酮,產(chǎn)物含量約為純化前5.6倍,這可能與其樣品中總黃酮的初始含量較低有關(guān)。綜上所述,確定的最佳純化工藝分離效果較好,適于沙棘果黃酮化合物的純化。

2.7 體內(nèi)抗運動性疲勞作用比較

運動耐力可反映機體抗運動性疲勞的程度,而負(fù)重游泳是常見評估身體抗疲勞能力的運動實驗?zāi)Ｐ?具有較好的重現(xiàn)性,因此考察不同劑量純化產(chǎn)物對小鼠的負(fù)重游泳時間長短的影響,結(jié)果見表4。從表4可知,與空白對照組相比,低劑量組小鼠的力竭游泳時間延長率為2.77%,有顯著性差異(P<0.05),而陽性對照、中、高劑量組小鼠的力竭游泳時間延長率分別為17.28%、8.60%和15.90%,有極顯著性差異(P<0.01),表明沙棘黃酮有助于延長動物運動時間,提高其運動耐力。

表4 沙棘黃酮對運動時間的影響

血糖是提供機體運動能量的主要來源之一,當(dāng)機體高強度運動后會造成體內(nèi)部分細(xì)胞缺氧,致使血糖發(fā)生糖酵解生成乳酸,蓄積在骨骼肌等組織中,出現(xiàn)四肢酸痛現(xiàn)象,產(chǎn)生疲勞感,而乳酸脫氫酶有利于催化乳酸脫氫形成丙酮酸,快速排出體外[23],因此體內(nèi)乳酸濃度和乳酸脫氫酶活力可較好反映機體疲勞程度。從表5可見,與空白對照組相比,陽性對照組和中、高劑量組小鼠的乳酸濃度分別降低17.18%、7.89%和13.23%,有極顯著性差異(P<0.01),而乳酸脫氫酶活力則分別提高26.97%、8.81%和16.57%,差異也具有極顯著性(P<0.01),表明沙棘黃酮有助于提高體內(nèi)乳酸脫氫酶活力,抑制體內(nèi)乳酸生成。

肝糖原與肌糖原是機體的重要儲能物質(zhì),當(dāng)體內(nèi)血糖不能維持高強度運動時,兩種糖原先后各自分解成葡萄糖,以維持體內(nèi)血糖水平[24]。從表5可知,與空白對照組相比,沙棘黃酮各劑量組動物的兩種糖原含量均明顯較高,低劑量組的差異具有顯著性(P<0.05),而陽性對照、中、高劑量組小鼠的差異則極顯著(P<0.01),表明沙棘黃酮有助于提高體內(nèi)肝糖原與肌糖原的儲備。

3 結(jié)論

本研究采用D101大孔樹脂分離純化沙棘果提取物中黃酮類化合物,該吸附量隨初始濃度的增加而增大,隨溫度的升高而降低,吸附等溫線符合Langmuir等溫吸附模型,吸附動力學(xué)過程符合準(zhǔn)一級動力學(xué)方程。通過“動態(tài)吸附-洗脫”試驗可知最佳純化工藝條件:70 mL 3 mg/mL上樣溶液(pH5.0),以1 mL/min流速上樣后,采用160 mL 70%乙醇溶液,在1 mL/min流速下洗脫,測得吸附率與洗脫率分別為88.15%和90.05%,產(chǎn)物的總黃酮純度由純化前18.25%±0.86%提高至純化后59.07%±1.82%,純化后約為純化前3.2倍。該工藝操作簡便、純化效率較高,不同劑量純化產(chǎn)物均可明顯增強機體的運動耐力和體內(nèi)的乳酸脫氫酶活力,有效降低乳酸濃度水平,并顯著提高肝、肌糖原的儲備,從而抗運動性疲勞作用較好。