張常仁，楊雅麗，程全國，劉亞軍，張春雨，何紅波，鮑雪蓮，解宏圖

(1.沈陽大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110044；2.中國科學(xué)院 沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016；3.遼寧省現(xiàn)代保護性耕作與生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，遼寧 沈陽 110016；4.吉林省梨樹縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，吉林 梨樹136500)

0 引 言

傳統(tǒng)耕作(翻耕、旋耕起壟)一直是我國東北地區(qū)主要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式，高強度的農(nóng)業(yè)耕作使黑土長期處于超負荷利用狀態(tài)，加之水土流失嚴重，導(dǎo)致黑土肥力逐年下降，嚴重影響了黑土地的耕地質(zhì)量，保護黑土地刻不容緩[1-2]。在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，土壤有機質(zhì)的積累及其穩(wěn)定性是衡量土壤質(zhì)量的核心。東北黑土自開墾以來，土壤有機質(zhì)的礦化分解過程加速，其含量下降了46%[3]。以減少耕作頻率及秸稈還田為核心的保護性耕作可以通過增加外源輸入，減少土壤擾動有效地降低自然因素對土壤的侵蝕作用，促進土壤有機質(zhì)的形成與穩(wěn)定，有效提升土壤有機質(zhì)數(shù)量和質(zhì)量，保證土壤的生產(chǎn)和生態(tài)功能[4-6]。

土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分直接參與土壤有機質(zhì)的分解和養(yǎng)分的循環(huán)轉(zhuǎn)化過程[7]。土壤微生物特性越來越多地被用于評估土壤健康，其生物量和活性表征著土壤質(zhì)量和有機質(zhì)遷移轉(zhuǎn)化的活躍程度[8-9]。研究表明，耕作方式影響土壤生物化學(xué)特性并最終通過改善土壤微生物群落組成和活性影響土壤有機碳的形成和轉(zhuǎn)化[10]。免耕通過減少擾動增加土壤微生物的生物量，秸稈的輸入使這種效果更為顯著[11]。秸稈的添加不僅為土壤輸入了大量的營養(yǎng)元素還可以改善土壤的理化性質(zhì)，進而影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能[12]。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，保護性耕作可以增加土壤有機碳的含量[13-14]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，免耕僅能增加表層幾厘米土壤及秸稈還田處有機碳的含量，土壤有機碳在表層的積累具有“飽和效應(yīng)”[15]。然而，與傳統(tǒng)的翻耕相比，長期的免耕及秸稈覆蓋還田后土壤性質(zhì)在耕層的變化如何影響土壤微生物量、微生物群落組成和活性，并且這些變化在不同土壤層次間的差異尚不明確。本研究利用位于吉林省梨樹縣的長期秸稈覆蓋免耕平臺，開展不同耕作模式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的研究，探討免耕秸稈還田對黑土土壤碳庫生物穩(wěn)定性的提升效果，為農(nóng)田可持續(xù)生產(chǎn)和高效管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗基地概況

試驗樣地位于吉林省梨樹縣大房身鄉(xiāng)高家村(43°19′N，124°14′E)的中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所保護性耕作研發(fā)基地。該基地始建于2007年，年平均氣溫為6.9 ℃，降雨量為614 mm，主要集中在6、7、8三個月，氣候類型為溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候。當?shù)胤N植模式以玉米連作為主。供試土壤為中層黑土，壤質(zhì)黏土。本底土壤pH值為7.1，土壤有機碳含量為11.3 g·kg-1，土壤全氮含量為1.2 g·kg-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗小區(qū)采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，3種不同耕作方式處理，分別為傳統(tǒng)耕作(Conventional tillage，CT)、免耕+無秸稈還田(No-tillage without stover，NT-0)、免耕+全量秸稈還田(No-tillage with total amount stover mulching，NT-100)，每個處理4次重復(fù)。每個小區(qū)面積為8.7 m×30 m。傳統(tǒng)耕作(CT)模式為翻耕并全部移除秸稈，免耕播種采用德邦大為免耕播種機(DEBONT型號：2205)操作，其中，免耕處理無秸稈還田(NT-0)在播種前將秸稈全部移除，免耕處理全量秸稈還田(NT-100)在播種前將收獲的全部秸稈均勻的覆蓋在土壤表面，秸稈長度約為50 cm。免耕處理模式下，除播種外全年不再對土壤進行擾動。各處理的肥料施用量相同分別為：氮(N)240 kg·hm-2、磷(P2O5)110 kg·hm-2、鉀(K2O)110 kg·hm-2。

1.3 樣品采集與測定

土壤樣品于2019年秋季收獲后采集，采用土鉆法，五點混合取樣。采樣深度為0～5 cm、5～10 cm和10～20 cm。采集后的樣品過2 mm篩，去除可見的石礫、秸稈殘渣和根系，一部分保存于4 ℃冰箱用于土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、水溶性碳氮和土壤酶活性的測定；另一部分保存于-20 ℃冰箱，用于磷脂脂肪酸(PLFA)測定。風(fēng)干土用于土壤酸堿度(pH)、全氮(TN)和土壤有機碳(SOC)測定。

1.3.2 土壤磷脂脂肪酸測定。將-20 ℃冰箱保存的土壤樣品冷凍干燥，取冷凍干燥后的樣品進行實驗。以磷酸為緩沖液，按照氯仿-甲醇單相萃取的方法提取磷脂脂肪酸(PLFA)，然后用硅膠柱進行純化、甲酯化，收集PLFA。將提取完畢的PLFA溶解于正己烷中，放在氣相色譜上進行測定。利用MIDI軟件(“Sherlock Microbial Identification System”，MIDI Inc.，Newark，DE，USA)測定PLFA的峰。參照PLFA生物標識物的數(shù)據(jù)庫，對微生物群落組成進行分析[17]：革蘭氏陽性菌(14:0iso、15:0iso、15:0anteiso、16:0iso、17:0iso和17:0anteiso)、革蘭氏陰性菌(16:1ω7c、17:1ω8c、18:1ω5c、18:1ω7c、17:0cyclo和19:0cyclo)、叢枝菌根真菌(16:1ω5c)、腐生真菌(18:1ω9c、18:2ω6c)和放線菌(16:0 10methyl、17:1ω7c 10methyl和18:0 10methyl)。

1.3.3 土壤微生物熵和土壤酶活性測定。總磷脂脂肪酸生物量與土壤有機碳的比值(PLFA biomass/SOC)表征土壤微生物熵。土壤酶活性采用微孔板熒光法，以0.1 mol·L-1三水合乙酸鈉為緩沖溶液，β-葡萄糖苷酶(βG)、纖維二糖酶(CB)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)以4-甲基傘形酮(MUB)為標液，亮氨酸氨基肽酶(LAP)以7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)為標液，過氧化氫酶(PER)、多酚氧化酶(PPO)以二羥苯丙胺酸(DOPA)為標液，酶標儀分光光度法測定酶活性[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2019和SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，對數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性進行檢驗，剔除特異性的數(shù)據(jù)。采用雙因素方差分析土層、耕作處理及兩者的交互作用，單個土層不同處理間采用單因素方差分析，運用多重比較(LSD)檢驗其顯著性(P<0.05)。應(yīng)用Canoco 5.0軟件進行主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同耕作模式對土壤理化性質(zhì)的影響

土壤理化性質(zhì)對不同土層、不同耕作處理的響應(yīng)不同(表1)。土壤有機碳(SOC)和全氮(TN)在不同土層、耕作處理及兩者的交互作用間差異顯著(P<0.001)。隨著土層的加深SOC和TN的含量顯著降低，表層0～5 cm最高，10～20 cm最低。0～5 cm土層NT-100處理的SOC和TN含量顯著高于CT和NT-0處理，5～10 cm土層NT-100處理的SOC含量顯著高于NT-0。10～20 cm土層各處理間的SOC和TN含量變化不大。土壤碳氮比只在不同土層間差異顯著(P<0.01)。0～5 cm土層碳氮比值顯著高于5～10 cm和10～20 cm土層。

土壤水溶性碳氮(DOC和DON)含量在不同土層間的差異達到顯著水平(P<0.01)，同時，DOC對耕作處理響應(yīng)顯著，而DON對兩者的交互作用響應(yīng)顯著(P<0.05)。0～5 cm土層DOC和DON含量顯著高于5～10 cm和10～20 cm。0～5 cm土層免耕(NT-100和NT-0)處理的DOC含量相較于傳統(tǒng)耕作(CT)顯著增加了27.8%和25.4%(P<0.01)，而DON含量在0～5 cm土層各耕作處理間變化不顯著；5～10 cm和10～20 cm土層CT和NT-0處理的DON含量顯著高于NT-100處理(P<0.01)。

表1 不同耕作模式下土壤理化指標Table 1 Soil physical and chemical indexes under different tillages

土壤酸堿度(pH)在不同土層間差異顯著(P<0.05)，隨土層加深pH值逐漸升高，10～20 cm土層顯著高于0～5 cm和5～10 cm土層。土壤含水量在不同土層和耕作處理間差異顯著(P<0.01)。10～20 cm土壤含水量顯著高于0～5和5～10 cm土層；NT-100處理土壤含水量顯著高于CT和NT-0處理，增加了12.6%和10.5%(表1)。

2.2 不同耕作模式對土壤微生物群落的影響

土壤微生物由細菌、真菌和放線菌組成，各類群磷脂脂肪酸生物量占總磷脂脂肪酸(TPLFA)的73.5%、9.7%和16.6%。其中，細菌可分為革蘭氏陽性菌和陰性菌，真菌可分為腐生真菌和叢枝菌根真菌?？偭字舅?TPLFA)、細菌、真菌、放線菌、革蘭氏陽性菌(G+)、革蘭氏陰性菌(G-)、腐生真菌(SF)和叢枝菌根真菌(AMF)(圖1)對不同土層、耕作處理及兩者的交互作用差異均顯著(P<0.05)。土壤微生物生物量及各類群生物量具有相同的變化趨勢，都隨土層加深而降低，0～5 cm土層生物量顯著高于5～10 cm和10～20 cm土層，且都表現(xiàn)為在0～5 cm土層NT-100處理顯著高于CT和NT-0處理，除了AMF之外，5～10 cm和10～20 cm土層各耕作處理間差異不顯著。AMF在5～10 cm土層CT處理的生物量顯著高于NT-100，而10～20 cm土層CT處理的生物量顯著高于免耕處理(NT-0和NT-100)。

注：CT，傳統(tǒng)耕作；NT-0，免耕+無秸稈還田；NT-100，免耕+全量秸稈還田。對土層(L)和耕作處理(T)及兩者的交互作用(L×T)進行雙因素方差分析，數(shù)值P<0.05時代表差異顯著。小寫字母代表同一土層不同耕作處理單因素方差分析結(jié)果，不同字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。Note:CT,Conventional tillage; NT-0,No-tillage without stover; NT-100,No-tillage with total stover.The soil layers (L),tillage treatments (T) and their interaction (L×T) were analyzed by two-factor variance analysis,the P value <0.05 represent significant differences.Lowercase letters represent One-factor variance analysis results of different tillage treatments in the same soil layer,with different letters indicate significant differences at P<0.05.The same is as below.圖1 不同耕作模式下土壤磷脂脂肪酸含量Fig.1 Soil microbial biomass of phospholipid fatty acids under different tillages

土壤微生物多樣性(H′)(表2)在不同土層及土層和耕作處理的交互作用間差異顯著(P<0.05)，10～20 cm土層H′顯著高于0～5 cm和5～10 cm土層。在0～5 cm土層NT-100處理的H′顯著低于CT處理，5～10 cm和10～20 cm各耕作處理間變化不顯著。

土壤微生物真細菌比值(表2)在不同土層間差異顯著(P<0.001)，隨土層加深而降低，0～5 cm土層的真細菌比值顯著高于5～10 cm和10～20 cm土層。代表土壤細菌結(jié)構(gòu)的G+/G-在不同耕作處理和土層間沒有顯著差異。代表土壤真菌結(jié)構(gòu)的AMF/SF在不同土層及土層和耕作處理的交互作用間差異顯著(P<0.001)，5～10 cm土層AMF/SF顯著高于0～5 cm和10～20 cm土層(5～10 cm>10～20 cm>0～5 cm)。在0～5 cm土層NT-100處理的AMF/SF顯著高于CT和NT-0處理，在5～10 cm土層NT-100處理顯著低于CT，而10～20 cm土層NT-100處理顯著低于CT和NT-0。

表2 不同耕作模式下土壤微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)變化Table 2 Changes of soil microbial community diversity and structure under different tillages

土壤微生物群落的主成分分析表明(圖2)，PCA 1和PCA 2軸分別解釋了不同耕作模式下36.5%和17.7%微生物群落結(jié)構(gòu)的變異。0～5 cm土層(綠色)與5～10 cm(橙色)和10～20 cm土層(紫色)在PCA1軸上顯著區(qū)分開來，表明土層對微生物群落結(jié)構(gòu)影響較大，而不同耕作處理在圖上分異不明顯。由PCA圖可以看出，影響0～5 cm表層的主要特征脂肪酸為革蘭氏陰性菌(cy17:0ω7c,16:1ω7c,18:1ω7c)、腐生真菌(18:2ω6c,18:1ω9c)和叢枝菌根真菌(16:1ω5c)。

注：基于所有鑒定的單獨磷脂脂肪酸：相對豐度>0.5% 以及碳原子數(shù)<24。CT，傳統(tǒng)耕作；NT-0，免耕+無秸稈還田；NT-100，免耕+全量秸稈還田，不同圖形代表不同耕作處理，不同顏色代表不同的土壤層次。Note: Using all identified phospholipid fatty acids (PLFA) at >0.5% and C atoms numbers <24.Different symbols represent different tillage treatments.CT,Conventional tillage; NT-0,No-tillage without stover; NT-100,No-tillage with total stover,and different colors represent different soil layers.圖2 不同耕作模式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主成分分析Fig.2 Principal component analysis (PCA) of soil microbial community structure under different tillages

2.3 不同耕作模式對土壤酶活性的影響

與碳轉(zhuǎn)化相關(guān)的β-葡萄糖苷酶(βG)和纖維二糖酶(CB)活性在不同土層、耕作處理及兩者的交互作用間均差異顯著(圖3a和b，P<0.05)。0～5 cm土層的βG和CB活性顯著高于5～10 cm和10～20 cm土層。在0～5 cm土層，NT-100處理碳轉(zhuǎn)化酶活性最高：其βG活性顯著高于CT和NT-0處理，CB活性顯著高于CT處理；在5～10 cm兩種酶在各耕作處理間的變化不顯著；在10～20 cm土層NT-100處理的CB活性顯著高于CT和NT-0處理。

與氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的亮氨酸氨基肽酶(LAP)和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性在不同土層間差異顯著(圖3c和d，P<0.05)，同時NAG活性還受土層與耕作處理的交互作用影響(P<0.01)。10～20 cm土層的LAP活性顯著高于0～5 cm和5～10 cm土層，而NAG則表現(xiàn)出相反趨勢。NAG在0～5 cm土層，免耕處理其活性(NT-0和NT-100)顯著高于CT，而在5～10 cm土層，NT-100其活性卻顯著低于CT和NT-0，10～20 cm土層各耕作處理間變化不顯著。

多酚氧化酶(PPO)和過氧化氫酶(PER)活性在不同土層間差異顯著(圖3e和f，P<0.001)，5～10 cm土層的PPO和PER活性顯著高于0～5 cm和10～20 cm土層。同時PER活性還受土層與耕作處理的交互作用影響(P<0.05)，在0～5 cm土層，NT-100處理的PER活性顯著高于CT和NT-0處理，而5～10 cm和10～20 cm各耕作處理間變化不顯著。

注：大寫字母代表不同土層的單因素方差分析結(jié)果。Note:Capital letters represent one-factor variance analysis results of different soil layers.圖3 不同耕作模式下土壤酶活性Fig.3 Soil enzyme activities under different tillages

2.4 微生物群落與土壤因子及酶活性的冗余分析

圖4 土壤微生物群落與土壤因子的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis (RDA) between soil microbial community and soil factors

表3 土壤微生物群落與土壤因子冗余分析結(jié)果Table 3 Redundancy analysis results of soil microbial community and soil factors

2.5 不同耕作模式對土壤微生物熵的影響

由磷脂脂肪酸生物量/土壤有機碳代表的土壤微生物熵(圖5)在不同土層、耕作處理及兩者的交互作用間差異顯著(P<0.05)。0～5 cm土層的微生物熵顯著高于5～10 cm和10～20 cm土層。0～5 cm土層NT-100處理的微生物熵顯著高于NT-0，而與CT處理差異不顯著。5～10 cm和10～20 cm土層各耕作處理間沒有顯著差異。

注：小寫字母代表同一土層不同耕作處理單因素方差分析結(jié)果，不同字母代表差異顯著(P<0.05)。Note: Lowercase letters represent one-factor variance analysis results of different tillage treatments in the same soil layer,with different letters indicate significant differences at P<0.05.圖5 不同耕作模式下土壤微生物熵(磷脂脂肪酸生物量/土壤有機碳)的變化Fig.5 Changes of soil microbial quotient represented by PLFA biomass/SOC under different tillages

3 討 論

3.1 不同耕作模式對土壤碳氮的影響

3.2 不同耕作模式對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

3.3 不同耕作模式對土壤酶活性的影響

土壤的生物化學(xué)反應(yīng)少不了土壤酶的參與，其活性代表著土壤生化過程的強弱，影響著土壤生態(tài)系統(tǒng)的代謝[30]。免耕秸稈還田顯著增加了表層土壤有機碳、全氮、水溶性碳含量，使土壤表層與碳氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶活性顯著提高。0～5 cm土層NT-100處理碳轉(zhuǎn)化相關(guān)的β-葡萄糖苷酶(βG)和纖維二糖酶(CB)、氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性均顯著高于CT處理。冗余分析結(jié)果也表明，0～5 cm土層NT-100處理下碳氮酶活性與細菌和叢枝菌根真菌呈正相關(guān)關(guān)系，免耕秸稈還田使表層微生物數(shù)量顯著增加，使其分解轉(zhuǎn)化所需的酶相應(yīng)增多[31]。0～5 cm土層NT-100處理過氧化氫酶(PER)活性增加主要是由于表層微生物數(shù)量增多的同時其呼吸所產(chǎn)生的過氧化氫增加，進而避免過氧化氫對微生物毒害作用的PER酶活性增加[32]。免耕條件下土壤微生物功能的提升，與土壤所能提供的生存環(huán)境和碳氮等營養(yǎng)元素有很大關(guān)聯(lián)，添加秸稈后不僅使碳氮等含量顯著增加，也對土壤表層形成一種保護，使其受環(huán)境因素(風(fēng)、水等)的影響減小，有利于微生物活性的提高[33]。亮氨酸氨基肽酶(LAP)其活性與β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)具有相反的趨勢，Li等[34]通過對兩種酶的分析發(fā)現(xiàn)，當土壤中可被直接利用的氮源較低時LAP酶活性就會降低。秸稈中的氮源需被微生物分解轉(zhuǎn)化，速效氮易隨水分向下層轉(zhuǎn)移，使下層LAP酶活性高于表層。土壤多酚氧化酶(PPO)在5～10 cm的活性顯著高于其余兩土層，這是由于高溫和缺氧都會使PPO活性降低[35]，而5～10 cm土層溫度比表層低，氧氣含量比下層高，適宜PPO酶的生存。免耕+全量秸稈還田(NT-100)處理增加了表層土壤碳氮含量和土壤微生物生物量，促使與微生物群落代謝相關(guān)的酶活性顯著升高。

3.4 不同耕作模式對土壤有機質(zhì)穩(wěn)定性的影響

土壤微生物熵代表著微生物對SOC的利用效率，數(shù)值越高微生物對土壤有機碳的利用效率越高。從微生物熵的分析來看，表層0～5 cm有外源有機物質(zhì)輸入的NT-100微生物熵最大，表明其土壤中有更多易于微生物利用的碳源[36]。NT-100碳氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶活性最高也證實了這一情況，微生物對外源有機質(zhì)的分解大于對土壤原有有機質(zhì)的分解，最終增加了土壤碳氮總含量；NT-0處理的微生物對SOC的分解能力低于CT，但統(tǒng)計沒有達到顯著水平。表明在沒有外源物質(zhì)輸入的條件下，CT和NT-0兩種處理分解的都是土壤本身的有機碳，這說明NT-0處理可以通過減少翻耕，降低微生物對SOC的分解速率從而增加土壤有機碳含量。范如芹等[37]和王淑蘭等[21]研究也證實了免耕通過減少對土壤的擾動來降低土壤有機碳的礦化速率使土壤有機質(zhì)含量增加。研究表明，與傳統(tǒng)耕作相比，長期免耕無秸稈還田處理可以增加土壤有機質(zhì)的含量及穩(wěn)定性，而當免耕系統(tǒng)中進行秸稈還田處理可以顯著增加土壤的微生物量及其活性，進而促進土壤有機碳的周轉(zhuǎn)和積累。

4 結(jié) 論

免耕+全量秸稈還田處理對比傳統(tǒng)耕作和免耕+無秸稈還田處理增加了0～5 cm土層土壤養(yǎng)分含量、微生物生物量及細菌、真菌、放線菌等類群微生物數(shù)量和碳氮相關(guān)的酶活性，促進土壤微生物對土壤有機質(zhì)的分解利用，增加土壤有機質(zhì)的穩(wěn)定性，是提升東北地區(qū)黑土有機質(zhì)含量和土壤微生物數(shù)量的一種有效的農(nóng)田管理模式。