劉永衡,陳 彬,王學(xué)英

(寧夏工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院能源化工學(xué)院,寧夏銀川 750021)

近年來,寧夏作為全世界迅速發(fā)展的新興葡萄酒產(chǎn)區(qū),銷售收入及產(chǎn)業(yè)綜合產(chǎn)值逐年飛速增長;截至2019年底,寧夏葡萄種植面積達(dá)到57萬畝,是全國最大的釀酒葡萄集中連片產(chǎn)區(qū),現(xiàn)有酒莊200余家,年產(chǎn)葡萄酒1.3億瓶,產(chǎn)業(yè)綜合產(chǎn)值達(dá)到260億元,寧夏葡萄酒產(chǎn)業(yè)目前已經(jīng)成為了寧夏經(jīng)濟(jì)增長幅度最快的特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)[1]。寧夏“十三五”規(guī)劃明確提出重點發(fā)展葡萄籽等相關(guān)高端保健品產(chǎn)品,形成獨具優(yōu)勢特色的新興產(chǎn)業(yè)[2]。然而,隨著葡萄產(chǎn)量的增長和葡萄加工業(yè)的極大發(fā)展,每年也產(chǎn)生了約占葡萄加工量25%左右的葡萄廢棄物,其中主要是葡萄皮、籽和果梗等。因此,如何利用葡萄酒釀造產(chǎn)生的皮籽廢棄物成為了新的科研焦點。

葡萄籽中含有大量的活性物質(zhì),例如酚類化合物[3-4]、脂肪酸[5-6]、維生素[7-8]以及植物甾醇[9-10]等,這些物質(zhì)具有多種活性功能,例如抗氧化[11-13]、細(xì)胞周期調(diào)控[14-15]、消炎[16]、抑菌[17-19]等活性。此外,隨著人們對生活質(zhì)量要求的提升,且由于食品安全問題引起的食源性疾病增加,使得研究者們對使用來自于草藥、香料等的植物提取天然抗菌化合物保存食品越來越感興趣。因此深入研究葡萄籽的抑菌活性及成分不僅可以進(jìn)一步明確葡萄籽活性成分的抑菌機(jī)理,也可以為開展葡萄籽皮綜合利用、提升產(chǎn)品附加值提供新的思路。目前有關(guān)于葡萄籽提取物抑菌活性的報道國內(nèi)外并不多見,本研究首次采用不同極性有機(jī)溶劑對來自于寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)兩種釀酒葡萄的葡萄籽進(jìn)行了初步分離提取,對各提取物的抑菌效果進(jìn)行了對比研究,此外,采用有機(jī)溶劑結(jié)合超聲波輔助提取了兩種葡萄籽油,并進(jìn)行了抑菌效果比對以及GC-MS分析,旨在能為其食用、藥用開發(fā)利用提供一定的基礎(chǔ)理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑比諾葡萄、梅鹿輒葡萄皮渣 寧夏西夏王葡萄酒業(yè)(集團(tuán))有限公司提供;金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCICC 10384,以下簡稱10384號菌株)、大腸桿菌(EscherichiacoliCICC 10389,以下簡稱10389號菌株)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCICC 10275,以下簡稱10275號菌株) 均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC),實驗室低溫保存;營養(yǎng)瓊脂 北京奧海星生物技術(shù)有限公司;氯化鈉、95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇 國產(chǎn)AR級別,廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心;乙酸乙酯 色譜純,美國Fisher公司;2-辛醇 標(biāo)準(zhǔn)品,美國Sigma公司;無水硫酸鈉 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI公司;YM-650CT恒溫超聲波提取機(jī) 上海豫明儀器有限公司;SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱、YXQ-50A型立式壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-2FD型無菌操作臺 上海博訊實業(yè)有限公司;PHSJ-4F型實驗室pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;梅特勒ME3002E型分析天平 梅特勒-托利多國際股份有限公司;Agilent-7890B-7000C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技公司;頂空固相微萃取纖維頭DVB/CA/PDMS(2 cm,50/30 μm) 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 葡萄籽95%乙醇浸提物不同有機(jī)溶劑萃取物制備 取兩種釀酒葡萄皮渣分別分離出葡萄籽,用水反復(fù)清洗脫去葡萄皮以及色素后實驗室保存陰干,烘箱70 ℃烘干,研磨至粉末狀態(tài),浸漬于95%乙醇(參照熊亞平等[20]方法),避光密閉保存1個月,備用。取葡萄籽95%乙醇浸漬液減壓蒸餾除去溶劑后得337.7 g粗浸膏(即95%乙醇浸提物樣品,以下簡稱為TE),將粗浸膏溶于1 L溫水中(60 ℃),再用石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取,萃取溶劑均為1 L。石油醚萃取層減壓濃縮得23.6 g浸膏(即95%乙醇浸提物石油醚萃取樣品,以下簡稱為TEP),乙酸乙酯萃取層減壓濃縮得12.7 g浸膏(即95%乙醇浸提物乙酸乙酯萃取樣品,以下簡稱為TEE),正丁醇萃取層減壓濃縮得49.3 g浸膏(即95%乙醇浸提物正丁醇萃取樣品,以下簡稱為TEN)。各提取浸膏用DMSO溶解,制備成0.50 g/mL的原始溶液,保藏備用。

1.2.1.2 葡萄籽油制備 參照趙芙蓉[21]實驗方法,將黑比諾葡萄、梅鹿輒葡萄的葡萄籽分別烘干至恒重,經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過60目篩,準(zhǔn)確稱取葡萄籽粉各10 g于錐形瓶中,加入有機(jī)溶劑100 mL(正己烷70 mL、石油醚30 mL),密封,在溫度50 ℃、功率280 W下超聲提取30 min,隨后將超聲提取溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空抽濾濃縮,最終得到葡萄籽油粗品(黑比諾葡萄籽油樣品簡稱為Oil-1,梅鹿輒葡萄籽油樣品簡稱為Oil-2),加入烘干無水硫酸鈉備用,供抑菌實驗及GC-MS分析。

1.2.2 供試菌株的活化及平板涂布培養(yǎng) 制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,在121 ℃、0.1～0.15 MPa、30 min條件下高壓滅菌,一部分制備試管斜面培養(yǎng)基,接種供試菌種后置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h。另一部分制備平板培養(yǎng)基,挑取斜面培養(yǎng)菌落于EP管中,接種于250 mL三角瓶中,置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后,將菌液取出,無菌水稀釋成濃度為每毫升106個細(xì)胞的菌液,即OD=0.5～0.6的菌液。另取5 mL稀釋菌液分散涂布于直徑100 mm培養(yǎng)皿上,恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.2.3 抑菌圈及最低抑菌濃度(MIC)的測定 采用濾紙片擴(kuò)散法[22],將1.2.1.1中DMSO溶解原始樣品溶液分別配成0.20、0.10、0.05、0.02 g/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,打孔器制作直徑5 mm濾紙圓片,高壓滅菌后將濾紙片放入各濃度試驗樣品溶液中浸泡30 min,兩個葡萄籽油樣品不稀釋,直接浸泡30 min,干燥備用,由于葡萄籽油成分和石油醚萃取物所含成分較相似,因此選取近似密度的0.9 g/mL石油醚萃取物作為葡萄籽油樣品的參照。無菌條件下,將供試樣品浸泡干燥濾紙片用無菌鑷子放置在含菌平板上,每個平皿放置4片,且間隔一定的距離。以浸泡過DMSO溶液的濾紙片作為空白對照(CK),放置在培養(yǎng)皿中央。然后將培養(yǎng)皿置于恒溫生化箱37 ℃培養(yǎng)24 h。最后觀察菌落生長情況,觀察并用精密測量尺測定抑菌圈直徑,抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)參照蔡一鳴等方法[23],界定“強(qiáng)、較強(qiáng)、中等、較弱、極弱”五個等級,抑菌圈直徑20 mm以上為強(qiáng)抑菌效果,15～20 mm為較強(qiáng)抑菌效果,10～14 mm為中等抑菌效果,7～9 mm為較弱抑菌效果,7 mm以下為極弱抑菌效果,各稀釋液的每項抑菌實驗均平行重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 葡萄籽油化學(xué)組成成分分析

1.2.4.1 葡萄籽油樣前處理 取1 mL葡萄籽油提取物溶解于1 mL色譜純乙酸乙酯中,混勻后,1000 r/min離心,取上清液用于分析。

1.2.4.2 葡萄籽油樣GC-MS檢測條件 氣相色譜分離條件:色譜柱:HP-INnowax Polyethylene Glycol(30. 0 m×0.25 mm×0.25 μm)進(jìn)樣口溫度280 ℃;分流進(jìn)樣,分流比10∶1。柱溫為50 ℃(保留2 min),以4 ℃/min升溫至230 ℃保持20 min;汽化室溫度250 ℃;載氣為高純He(99. 999%),柱前壓5.08 psi,載氣流量2.0 mL/min,進(jìn)樣量2 μL,每個樣品均平行重復(fù)3次。

質(zhì)譜檢測條件:GC-MS傳輸線溫度280 ℃,EI離子源溫度為230 ℃,電子能量70 eV,光電倍增器電壓1937 V,質(zhì)量掃描范圍為m/z 10～450 amu。由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計算機(jī)在NIST17標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索及WILEY質(zhì)譜圖庫比對,譜庫比對時要求匹配度大于700。鑒定出大部分峰。結(jié)果用峰面積歸一化法計算出各成分的相對含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010對樣本(n=3)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄籽95%乙醇浸提物不同有機(jī)溶劑萃取物及葡萄籽油抑菌效果

圖1A為TE樣品對三種細(xì)菌的抑菌圈直徑,TE對10384、10389號菌株的生長均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制效果,濃度在0.20 g/mL時對10384號菌株顯示出強(qiáng)抑菌效果,抑菌直徑達(dá)到了21.2 mm;對10389號菌株顯示出較強(qiáng)抑菌效果,抑菌直徑達(dá)到了19.6 mm;即使是在濃度為0.02 g/mL時TE對10384、10389號菌株也表現(xiàn)出一定的抑制效果。但對10275號菌株的抑菌效果一般,僅在0.20、0.10 g/mL濃度時表現(xiàn)出中等、較弱的抑菌作用,0.05 g/mL以下濃度已經(jīng)檢測不到抑制效果。此外,TE對10384、10389號菌株的MIC為0.02 g/mL,對10275號菌株的MIC為0.10 g/mL,而CK對三種供試細(xì)菌均無效果。

圖1B為TEP樣品對三種細(xì)菌的抑菌圈大小直徑,相比較于10389、10275號菌種,10384號供試菌種對TEP表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性,在0.20 g/mL濃度下表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用,其MIC為0.05 g/mL;而TEP僅在0.10 g/mL時對10389號供試菌株、0.20 g/mL時對10275號供試菌株有較弱的抑菌效果。

圖1C為TEE樣品對三種細(xì)菌的抑菌圈直徑,對比TE及TEP樣品的抑菌效果,TEE對三種細(xì)菌的抑制效果明顯較差,對10384號供試菌種僅在0.20 g/mL濃度時現(xiàn)出較弱的抑制效果,低于0.20 g/mL濃度無抑菌效果;對10389、10275號供試菌株在0.20 g/mL濃度時分別顯示出中等及較弱抑菌效果,低于0.10 g/mL濃度已檢測不出抑菌效果。

圖1D為TEN樣品對三種細(xì)菌的抑菌圈直徑,TEN對三種供試菌種均表現(xiàn)出明顯的抑菌效果,其中10384號、10389號供試菌株對樣品溶液的敏感性明顯強(qiáng)于10275號供試菌株。在0.20 g/mL濃度時對10384、10389號供試菌株顯示出強(qiáng)抑菌效果,對10275號菌株顯示出較強(qiáng)抑菌效果;即使在濃度為0.02 g/mL時,10384、10389號供試菌株也對TEN表現(xiàn)出一定的抑菌效果;TEN對10384號、10389號供試菌株的MIC為0.02 g/mL,對10275號供試菌株的MIC為0.05 g/mL。

圖1E為兩種葡萄籽油Oil-1、Oil-2對三種細(xì)菌的抑菌圈直徑,相比較于0.9 g/mL TEP樣品,兩種葡萄籽油對三種供試菌種均表現(xiàn)出極弱的抑菌效果。

圖1 葡萄籽提取物對三種細(xì)菌的抑菌效果

2.2 葡萄籽油GC-MS檢測結(jié)果分析

黑比諾葡萄籽油樣品(Oil-1)及梅鹿輒葡萄籽油樣品(Oil-2)的GC-MS總離子流譜圖見圖2,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索比對,Oil-1及Oil-2中各組分鑒定分析結(jié)果分別見表1。

表1 黑比諾葡萄籽油(Oil-1)、梅鹿輒葡萄籽油(Oil-2)化學(xué)成分GC-MS分析結(jié)果

圖2 黑比諾葡萄籽油(Oil-1)、梅鹿輒葡萄籽油(Oil-2)總離子流色譜圖

由圖2、表1可知,黑比諾葡萄籽油(Oil-1)共鑒定出11個化合物,包括5種酯類、5種脂肪酸以及1種醛類化合物,其中相對含量最高的為亞油酸(55.36%),其次為亞油酸戊酯(10.73%),硬脂酸(6.47%);梅鹿輒葡萄籽油(Oil-2)共鑒定出10個化合物,和Oil-1成分種類接近一致,包括5種酯類、4種脂肪酸以及1種醛類化合物,相對Oil-1成分只少了一種脂肪酸(ω-二十三烯酸),其中相對含量最高的為亞油酸(43.97%),其次為亞油酸戊酯(18.10%),硬脂酸(8.22%);此外,除亞油酸以外,Oil-1中其他所有成分的含量均低于Oil-2中相同的成分,Oil-1和Oil-2中酯類含量總計分別為22.37%和36.73%,脂肪酸含量總計分別為75.27%和59.88%。

3 討論與結(jié)論

本研究采用三種典型的致病細(xì)菌對葡萄籽不同極性有機(jī)溶劑提取物及兩種葡萄籽油進(jìn)行了抑菌效果初步測試。整體來看5個葡萄籽提取物樣品中抑菌效果由強(qiáng)到弱的順序為較TEN>TE>TEP>TEE>Oil-1、Oil-2,TE樣品對10384號供試菌株、10389號供試菌株抑菌活性較強(qiáng),對10275號供試菌株抑菌效果較弱;而TEN樣品對三種供試細(xì)菌都表現(xiàn)出了較好的抑菌活性,這可能和正丁醇萃取物含有大量多酚、生物堿之類的大極性化合物有關(guān)。Subramanian等研究表明,葡萄籽中含有的白藜蘆醇等酚類化合物表現(xiàn)出的抗菌活性涉及誘導(dǎo)細(xì)菌膜,特別是大腸桿菌的氧化損傷,但不影響宿主細(xì)胞,因此具有抑菌活性[24],此外,葡萄籽中含有的原花青素也屬于多酚類化合物,也具有一定的抑菌活性[25]。而根據(jù)之前方法中所述蔡一鳴等[23]實驗方法,抑菌圈直徑20 mm以上為強(qiáng)抑菌效果,因此總體來說TE及TEN可以評價為高活性抗菌樣品。TEP樣品僅對10384號供試菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性,對于10389號供試菌株和10275號供試菌株的抑菌作用一般;進(jìn)一步提取了兩種釀酒葡萄的葡萄籽油,并且根據(jù)相似密度比重選取了0.9 g/mL TEP樣品作為參照測試了抑菌活性,兩個葡萄籽油樣品均表現(xiàn)出極弱的抑菌活性,抑菌圈直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0.9 g/mL TEP樣品,這與Berradre等人研究的結(jié)果并不一致,其利用正己烷為溶劑采用索氏提取裝置提取了一種歐亞葡萄(Vitisvinifera)的葡萄籽油,抑菌實驗顯示該葡萄籽油對實驗采用的5種細(xì)菌均有殺菌活性[26]。推測原因可能是95%乙醇浸提的時間較長,因此TEP樣品里含有的抑菌有效成分要高于有機(jī)溶劑結(jié)合微波輔助提取的葡萄籽油。

采用GC-MS技術(shù)分析了兩種葡萄籽油的化學(xué)成分(因受技術(shù)限制,本研究暫時未測定TEP的化學(xué)成分),結(jié)果表明其化學(xué)成分主要為脂肪酸和酯類,兩種葡萄籽油化學(xué)成分種類差異較小,但相同成分的含量有明顯差異,黑比諾葡萄籽油脂肪酸總含量(Oil-1:75.27%)明顯高于梅鹿輒葡萄籽油(Oil-2:59.88%),但酯類總含量低于梅鹿輒葡萄籽油(Oil-1:22.37%、Oil-2:36.73%),此外,黑比諾葡萄籽油亞油酸含量明顯高于梅鹿輒葡萄籽油,還含有ω-二十三烯酸。之前大部分關(guān)于葡萄籽油化學(xué)成分的研究主要集中在脂肪酸種類及含量,普遍采用甲酯化前處理葡萄籽油樣品后再進(jìn)行GC-MS分析,例如張云濤等以八種葡萄籽為原料,采用超臨界CO2流體萃取設(shè)備提取葡萄籽油,甲酯化結(jié)合GC-MS分析法檢測其主要脂肪酸百分含量,結(jié)果表明在葡萄籽油中,亞油酸含量最高,其次是油酸[27],這也與本研究的結(jié)果是一致的。本研究對葡萄籽油樣品直接進(jìn)行GC-MS分析不僅檢測到了脂肪酸,還檢測到了其它成分,對于葡萄籽油的化學(xué)成分及檢驗方法研究有一定的參考意義。

此外,利用有機(jī)溶劑輔助超聲波提取的兩個葡萄籽油樣品抑菌效果明顯低于相似樣品TEP,推測采用該方法提取的葡萄籽油抑菌活性成分較少,之前有報道稱葡萄籽油冷榨提取相對于有機(jī)溶劑提取可以保留更多對健康有益的成分[28],但提取方法是否和抑菌活性顯著相關(guān)仍需要進(jìn)一步研究。與TEP、TEN樣品相比,TEE樣品對三種細(xì)菌的抑菌作用效果最差。最后,通過對比圖1A～1E所有數(shù)據(jù)可以看出,10275號菌株對所有樣品溶液的敏感性幾乎均弱于10384號和10389號菌株,這可能與10275號菌株屬于芽孢桿菌有關(guān),而該類細(xì)菌的典型特點之一為抵抗外界不良環(huán)境能力較強(qiáng)。

本試驗僅對葡萄籽提取物及葡萄籽油進(jìn)行了初步的抑菌研究,可以為其藥用、食用開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)支持,其中TEN樣品有望用于后期化妝品、食品保鮮添加劑的研發(fā),但對于其具體的抑菌活性物質(zhì)分析及抑菌原理還有待進(jìn)一步進(jìn)行活性導(dǎo)向的化學(xué)成分分離與鑒定研究。