王楊陽,劉良忠,周雪琴

(武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023)

硒是人體必需的一種微量元素,是谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性中心,參與人體內(nèi)多種含硒酶和含硒蛋白的合成,具有增強機體免疫力、抗衰老、預防多種疾病等功效。而硒攝取不足可能引起多種疾病的產(chǎn)生,克山病、大骨節(jié)病就是典型的地方性硒缺乏癥[1-4]。但是,硒的分布很不均勻,世界上大部分地區(qū)都缺硒,特別是我國,超過70%的地區(qū)硒缺乏。因此,攝食富硒食品已成為保障國民健康的一個重要手段,而食用菌就是最好的富硒載體之一[5-6]。平菇在生長過程中已被證明具有較強的富硒耐硒能力,其品種較為豐富,是我國當前栽培產(chǎn)量最高的四大食用菌種之一。普通平菇中,每100 g干菇中蛋白含量高達19～26 g,脂肪1.0～2.3 g,屬于低熱量食品;游離氨基酸也較為豐富,含有丙氨酸、亮氨酸等共23種,符合聯(lián)合國糧食組織與世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)對于氨基酸組成的推薦。富硒平菇與普通同菌株平菇在外觀、色澤及口感上無明顯區(qū)別,而富硒平菇較其它富硒保健品具有成本低、生產(chǎn)工藝簡單等優(yōu)勢[7-8]?，F(xiàn)有研究表明,富硒平菇中的硒蛋白占比為73.3%～77.5%,具有較高的營養(yǎng)價值與藥用價值,是一種新型的優(yōu)質(zhì)植物蛋白[9-11]。

目前,對于植物蛋白肽制備工藝的研究較多,主要為大豆肽、玉米肽、花生肽等。李楊等[12]對超聲輔助酶解制備紅豆多肽的工藝進行優(yōu)化,確定最優(yōu)超聲輔助酶解工藝為:堿性蛋白酶添加量3.5%,超聲功率346 W,反應溫度60 ℃,反應時間92 min,pH為8.4,紅豆多肽得率為85.84%。馬雪等[13]以玉米漿為主要試驗原料,進行酶法水解玉米漿制備玉米肽的研究,從酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶中篩選最適試驗用酶。結(jié)果表明:以水解度(DH)為指標,中性蛋白酶水解玉米漿制備玉米肽水解度最高,當酶和底物比為3%(w/w)、pH為7.5、55 ℃下水解6 h時,玉米漿的水解度最高,可達到44.5%。王可等[14]以生花生粕作為原料,研究中性蛋白酶制備花生蛋白肽的酶解工藝。結(jié)果表明,在溫度為42 ℃,pH為8.25,酶比底物濃度為9%時,水解度達到最優(yōu)值46.13%,為花生蛋白肽的工業(yè)化生產(chǎn)及活性研究提供了基礎數(shù)據(jù)。而關(guān)于富硒平菇蛋白水解工藝的研究未見報道。因此,如何以低成本獲得高提取率、高營養(yǎng)價值的硒蛋白肽還有很大的研究空間。

本研究針對上述問題,以富硒平菇粉為原料,采用堿性蛋白酶對其進行水解,在單因素實驗的基礎上,利用正交試驗對水解條件進行優(yōu)化,獲得最佳水解工藝,并測定每g蛋白肽中硒含量。該研究的結(jié)果對硒蛋白肽資源的開發(fā)利用具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富硒平菇粉 總硒含量為150 mg/kg(其中蛋白硒占比為76.4%),湖北圣峰藥業(yè)有限公司提供;堿性蛋白酶(20萬U/g) 安琪酵母股份有限公司;中性蛋白酶(20萬U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(50萬U/g) 南寧東恒華道生物科技有限責任公司;鹽酸、硫酸 分析純,中國平煤神馬集團開封東大化工有限公司;硫酸銅、硼酸、氫氧化鈉 分析純,天津市凱通化學試劑有限公司;硫酸鉀 分析純,天津市天力化學試劑有限公司;無水碳酸鈉 分析純,天津市廣成化學試劑有限公司。

T6紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;PHS-3CpH計 上海精密科學儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州科豐儀器設備有限公司;LD5-10低速離心機 北京醫(yī)用離心機廠;AL204分析天平上 海右一儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解工藝流程 原料預處理→水浴鍋保溫→調(diào)節(jié)pH→加蛋白酶→反應2 h(加堿液維持pH,并記錄消耗堿液的體積)→沸水浴滅酶→離心→上清液→凍干

1.2.2 原料預處理 平菇粉細胞壁內(nèi)部的伸展蛋白和一些附著蛋白,立體結(jié)構(gòu)緊密復雜,而且酶切位點被包藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部,很難被蛋白酶水解,必須經(jīng)預處理才有利于蛋白酶的進攻。特別是包埋在膳食纖維中的伸展蛋白,是一種具有特殊結(jié)構(gòu)的糖蛋白,只有加熱變性才能提高可溶性蛋白肽的提取率[15-16]。因此,根據(jù)試驗需求將平菇粉用純水配制成一定料液比的懸液,然后經(jīng)90 ℃水浴加熱攪拌15 min,冷卻至適宜溫度。

1.2.3 蛋白酶的篩選 取富硒平菇粉配制成料液比為1∶30的懸液三份,經(jīng)預處理后按3000 U/g(以底物蛋白質(zhì)質(zhì)量計)的添加量依次添加木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶,調(diào)節(jié)溫度、pH至各種酶理論最適值[17-18],酶解2 h(水解時加堿液維持pH,并記錄水解結(jié)束時消耗堿液的體積)后,沸水浴滅酶10 min,于4000 r/min離心10 min,然后計算水解度,選出平菇蛋白酶解效果最好的酶作為后續(xù)試驗用酶。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 料液比對酶解效果的影響 將富硒平菇粉加純水配成料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的懸液,經(jīng)預處理后冷卻至50 ℃放入恒溫水浴鍋保溫,調(diào)pH至9.0,堿性蛋白酶添加量為1000 U/g(以底物蛋白質(zhì)質(zhì)量計),水解2 h;水解過程中,不斷加入0.5 mol/L NaOH溶液維持pH為9.0。水解結(jié)束后記錄消耗堿液的體積,將水解產(chǎn)物沸水浴滅酶10 min,4000 r/min離心10 min,過濾取上清液,測定蛋白質(zhì)溶出率及水解度。

1.2.4.2 水解溫度對酶解效果的影響 將富硒平菇粉加純水配成料液比為1∶30的懸液五份,經(jīng)預處理后放入恒溫水浴鍋,分別將溫度調(diào)至40、45、50、55、60 ℃,然后再調(diào)pH至9.0,堿性蛋白酶添加量為1000 U/g(以底物蛋白質(zhì)質(zhì)量計),在各自溫度下水解2 h;水解過程中,不斷加入0.5 mol/L NaOH溶液維持pH為9.0。水解結(jié)束后記錄消耗堿液的體積,將水解產(chǎn)物沸水浴滅酶10 min,4000 r/min離心10 min,過濾取上清液,測定蛋白質(zhì)溶出率及水解度。

1.2.4.3 加酶量對酶解效果的影響 將富硒平菇粉加純水配成料液比為1∶30的懸液五份,經(jīng)預處理后冷卻至50 ℃放入恒溫水浴鍋保溫,調(diào)pH至9.0,堿性蛋白酶添加量分別為1000、2000、3000、4000、5000 U/g(以底物蛋白質(zhì)質(zhì)量計),水解2 h;水解過程中,不斷加入0.5 mol/L NaOH溶液維持pH為9.0。水解結(jié)束后記錄消耗堿液的體積,將水解產(chǎn)物沸水浴滅酶10 min,4000 r/min離心10 min,過濾取上清液,測定蛋白質(zhì)溶出率及水解度。

1.2.4.4 pH對酶解效果的影響 將富硒平菇粉加純水配成料液比為1∶30的懸液五份,經(jīng)預處理后冷卻至50 ℃,分別調(diào)pH至9.0、9.5、10.0、10.5、11.0,堿性蛋白酶添加量為1000 U/g(以底物蛋白質(zhì)質(zhì)量計),水解2 h;水解過程中,不斷加入0.5 mol/L NaOH溶液維持pH為9.0。水解結(jié)束后記錄消耗堿液的體積,將水解產(chǎn)物沸水浴滅酶10 min,4000 r/min離心10 min,過濾取上清液,測定蛋白質(zhì)溶出率及水解度。

1.2.4.5 水解時間對酶解效果的影響 將富硒平菇粉加純水配成料液比為1∶30的懸液五份,經(jīng)預處理后冷卻至50 ℃,調(diào)pH至9.0,堿性蛋白酶添加量為1000 U/g(以底物蛋白質(zhì)質(zhì)量計),分別水解1、2、3、4、5 h。水解過程中,不斷加入0.5 mol/L NaOH溶液維持pH為9.0。水解結(jié)束后記錄消耗堿液的體積,將水解產(chǎn)物沸水浴滅酶10 min,4000 r/min離心10 min,過濾取上清液,測定蛋白質(zhì)溶出率、水解度，并計算單位時間水解度增加量。

1.2.5 正交試驗 在單因素實驗基礎上,以富硒平菇蛋白水解度為主要判斷標準(同時測定蛋白質(zhì)溶出率作為參考),選出以下四個因素進行正交試驗。以料液比、水解溫度、加酶量、pH為考察因素,各選取三個水平,采用L9(34)試驗設計,以富硒平菇蛋白水解度為評價指標,確定最佳酶解工藝。試驗因素及水平表[19]見表1。

表1 堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白因素水平

1.3 指標測定

1.3.1 總氮含量測定 參照GB 5009.5-2016進行操作。

1.3.2 蛋白質(zhì)水解度的測定 水解度的測定采用pH-stat法[20-23]。

水解度(DH)的計算公式:

式中,B為水解所消耗的標準堿液量,mL;Nb為標準堿液濃度,0.5 mol/L;?為氨基酸的平均解離度(其值參考“1/?在不同條件下的校正系數(shù)[24]”);M為底物蛋白質(zhì)的總量,g;htot,每克底物蛋白質(zhì)具有的肽鍵毫摩爾數(shù),對于平菇蛋白參考值取8.0 mmol/g。

1.3.3 蛋白質(zhì)溶出率的測定 計算公式如下[25]。

蛋白質(zhì)溶出率(%)=(水解液中總氮×水解液質(zhì)量-加酶質(zhì)量)/(原料總氮×原料克數(shù))×100

1.3.4 總硒含量的測定紫外分光光度法 準確稱取0.1 g樣品于100 mL燒杯中,加入10 mL硝酸和4 mL高氯酸,冷消化過夜(18 h以上)。同樣的方法得到空白、硒標準品。次日在通風櫥內(nèi)電爐上緩慢加熱,懸掛溫度計觀察溫度,溶液開始冒白煙。隨溫度升高,白煙加劇,約2 min。將電爐旋鈕調(diào)低至溶液微沸,溶液減少,白煙減弱,繼續(xù)消化。約3 min后消化至8 mL左右低溫微沸。待溶液呈無色或微黃色時(不可蒸干)消化結(jié)束,冷卻取下。平行三次。絡合:取消化液于15 mL離心管。加入0.5 mL 5% EDTA-2Na溶液和1.5 mL 1%鄰苯二胺,加超純水定容到10 mL,室溫反應40 min。移入4 mL環(huán)己烷。振搖3 min。靜置離心,取上層,測330 nm處吸光度。同樣的方法得到空白。根據(jù)測得的1、2、3、4、5 μg/mL硒標準品的吸光度值,以硒濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制硒標準曲線。硒標準曲線為y=0.1673x-0.0680,決定系數(shù)R2=0.9932[26-29]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復三次取平均值,采用Origin 9.0和SPSS Statistics 19進行數(shù)據(jù)分析,將數(shù)據(jù)輸入軟件中進行計算及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類的選擇

從圖1可看出,在理論最適作用條件下,蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解度大小順序為:堿性蛋白酶>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶。研究表明,堿性蛋白酶是一種良好的水解植物蛋白質(zhì)的酶劑,且相較于其它兩種蛋白酶,由于其成本較低,更廣泛的被應用到工業(yè)生產(chǎn)中[30]。所以選用堿性蛋白酶進行單因素以及正交試驗,對酶解工藝進行詳細地討論。

圖1 不同蛋白酶對富硒平菇蛋白水解度的影響

2.2 堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白單因素實驗

2.2.1 料液比對酶解效果的影響 為了保證富硒平菇蛋白的酶解效果,從生產(chǎn)多肽的角度出發(fā),在工藝優(yōu)化時以水解度作為主要評價指標,同時測定蛋白質(zhì)溶出率作為參考。單因素實驗方差分析結(jié)果表明,料液比對堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解度有顯著影響(P<0.05)。從圖2可看出,在水解溫度、加酶量、pH、水解時間相同的情況下,隨著料液比的持續(xù)增大,富硒平菇蛋白的水解度呈現(xiàn)先增大后減小”的趨勢。當料液比為1∶30時,水解度出現(xiàn)峰值。底物富硒平菇粉的量一定時,當料液比在1∶10～1∶30,純水的量逐漸增加,加快了酶與底物在樣品溶液體系中流動性,增大了酶與底物充分接觸的幾率,促進了水解反應,使得富硒平菇蛋白的水解度不斷增大;繼續(xù)增加純水的量至料液比為1∶50,對反應體系而言,酶的濃度降低,其與底物不能達到最佳作用點,酶與底物不能充分效地接觸,造成富硒平菇蛋白水解度降低[31]。另一方面,當料液比為1∶30～1∶50時,蛋白質(zhì)溶出率變化幅度較小。因此,選擇料液比為1∶30。

圖2 料液比對水解度和蛋白質(zhì)溶出率的影響

2.2.2 溫度對酶解效果的影響 單因素實驗方差分析結(jié)果表明,水解溫度對堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解度有非常顯著地影響(P<0.01)。從圖3可看出,在料液比、加酶量、pH、水解時間相同的情況下,當水解溫度在40～55 ℃之間時,蛋白質(zhì)水解度隨著溫度升高不斷增大;溫度為55 ℃時,蛋白質(zhì)水解度最高;當溫度高于55 ℃時水解度開始減小,因為水解溫度過高時酶活受到抑制,水解度會相應減小[32-33]。同時,隨著溫度的不斷升高,蛋白質(zhì)的溶出率也在不斷地升高,當水解溫度達到50 ℃后,蛋白質(zhì)溶出率在70%上下波動。從生產(chǎn)肽的角度看,在水解度最高時的蛋白質(zhì)溶出率也可接受,因此水解溫度選擇55 ℃。

圖3 水解溫度對水解度和蛋白質(zhì)溶出率的影響

2.2.3 加酶量對酶解效果的影響 單因素實驗方差分析結(jié)果表明,加酶量對堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解度有非常顯著地影響(P<0.01)。從圖4可看出,在料液比、水解溫度、pH、水解時間相同的情況下,堿性蛋白酶添加量為1000～4000 U/g時,水解度與加酶量成正相關(guān);當堿性蛋白酶添加量超過4000 U/g后,水解度趨于平穩(wěn);這是因為當酶的濃度相對于底物濃度較高的情況下,反應速率由底物濃度決定[34],所以繼續(xù)增加酶用量,富硒平菇蛋白水解度不再增大。而且當堿性蛋白酶添加量為4000～5000 U/g時,蛋白質(zhì)溶出率也逐漸趨于平穩(wěn)。因此,從節(jié)約成本的角度出發(fā),加酶量選擇4000 U/g。

圖4 加酶量對水解度和蛋白質(zhì)溶出率的影響

2.2.4 pH對酶解效果的影響 pH對酶促反應的影響是多方面的,過酸或過堿都會使酶發(fā)生可逆性或不可逆性的失活,也可通過改變酶的空間構(gòu)象而使其失去活性,且pH還可以改變底物的解離狀態(tài),影響其與酶的結(jié)合[35]。每種蛋白酶都有其和底物反應的最適pH范圍。通過查閱安琪堿性蛋白酶應用條件可知,其給定的最適作用pH為10.0。在正交試驗中,我們選取pH水平分別為9.5、10.0、10.5,這是考慮到在單因素試驗中,pH在9.0～10.5之間時,水解度和蛋白質(zhì)溶出率雖呈上升趨勢,但是增量較小;另一方面,預實驗也證實了在pH10.5附近取梯度不能達到優(yōu)化工藝條件的目的。單因素實驗方差分析結(jié)果表明,pH對堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解度有非常顯著地影響(P<0.01)。從圖5可看出,在料液比、水解溫度、加酶量、水解時間相同的情況下,pH在9.0～10.5時,富硒平菇蛋白水解度隨著pH的增大而增大;當pH為10.5時,富硒平菇蛋白水解度達到最大;當pH超過10.5時,富硒平菇蛋白水解度隨著pH的增大呈下降趨勢。同時,當pH為10.5時,蛋白質(zhì)溶出率也為最高。因此,可確定堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的最適pH為10.5。

圖5 pH對水解度和蛋白質(zhì)溶出率的影響

2.2.5 水解時間對酶解效果的影響 單因素實驗方差分析結(jié)果表明,水解時間對堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解度有極顯著地影響(P<0.01)。從圖6可看出,在料液比、溫度、加酶量、pH相同的情況下,隨著時間的不斷增加,蛋白質(zhì)水解度也不斷增大;同時,隨著時間的增加,蛋白質(zhì)溶出率也是在不斷地升高。在水解時間為5 h時,水解度和蛋白質(zhì)溶出率均達到最大值,并且蛋白質(zhì)溶出率在4 h后增加緩慢。為了更直觀地看出水解時間對水解度的影響,每小時水解度增加量的變化趨勢如圖7。從圖7可知,隨著時間的推移,雖然水解度在不斷增大,但是水解度增加量在2～4 h時相對平穩(wěn),而在4 h之后增加量變少。水解度在4 h后增加緩慢,變化不明顯。這是因為隨著酶解過程時間不斷延長,底物會不斷變少,水解度因此不再顯著增加[35]?？紤]到酶解時間過長,會消耗較多的熱能,增加生產(chǎn)成本,所以選擇水解時間為4 h,在后續(xù)正交試驗中水解時間不再作為考察因素。

圖6 水解時間對水解度和蛋白質(zhì)溶出率的影響

圖7 單位時間水解度增加量的變化

2.3 正交試驗分析

從表2比較R值的大小可知,影響堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白因素的主次順序依次為:D(pH)>C(加酶量)>B(水解溫度)>A(料液比),由此可見,pH對的富硒平菇蛋白水解度影響較大。其水解條件的最佳組合為A2B2C3D3,即料液比為1∶30,水解溫度為55 ℃,加酶量為4200 U/g,pH為10.5,在此條件下,富硒平菇蛋白的水解度可達到28.46%,蛋白質(zhì)溶出率為82.85%;表2的9個試驗組合中的最佳組合為A2B1C2D3,即料液比為1∶30,水解溫度為50 ℃,加酶量為4000 U/g,pH為10.5,此時富硒平菇蛋白的水解度為26.92%,蛋白質(zhì)溶出率為73.70%。由上可知,A2B2C3D3為堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的最佳條件組合,采用1.2.9中的方法測得水解所得蛋白肽中硒含量為2739.78 μg/g。

表2 堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白正交試驗結(jié)果

由表3,根據(jù)正交試驗方差分析[36]可知,其修正模型P值為0,小于0.05,說明正交試驗方差分析模型是適用的。溫度、加酶量與pH的P值均小于0.01,對富硒平菇蛋白水解度的影響均達到極顯著水平,料液比的P值在0.01與0.05之間,說明對富硒平菇蛋白水解度的影響達到顯著水平。

表3 堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白方差分析

3 結(jié)論

本研究在單因素實驗的基礎上,以水解度為最終評價指標,通過正交試驗對堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的工藝進行優(yōu)化,得出的最佳水解條件為:料液比1∶30,水解溫度55 ℃,加酶量4200 U/g,pH10.5。在此條件下,富硒平菇蛋白的水解度可達到28.46%,蛋白質(zhì)溶出率為82.85%,水解所得蛋白肽中硒含量為2739.78 μg/g。通過方差分析可知,正交分析法能夠有效地優(yōu)化堿性蛋白酶水解富硒平菇蛋白的水解條件。應用本文中的方法水解富硒平菇蛋白,其水解度(28.46%)和蛋白質(zhì)溶出率(82.85%)均較高,這對富硒平菇蛋白的開發(fā)和利用有一定的參考意義。本文尚未研究平菇硒蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和有機硒形態(tài),今后應著重開展此方面研究,為富硒平菇硒蛋白的高值化利用提供科學依據(jù)。