王旭捷,陳春鳳,楊 慧,李 潔,楊曉萍

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院,園藝植物生物學(xué)教育部點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430070)

茶多酚(tea polyphenols,TP)是茶葉中含有的多種不同酚類及其衍生物的總稱;研究表明TP具有抗氧化、抑菌、防癌抗癌、抗輻射、防突變等作用,還具有阻斷脂肪物質(zhì)氧化、保持人體生理活性以及緩解運(yùn)動(dòng)疲勞的作用[1-2]。TP的分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基,分子內(nèi)有大的π鍵共軛體系和強(qiáng)配位的氧原子,這樣的空間構(gòu)型使其具有較強(qiáng)的絡(luò)合金屬離子的能力,是金屬離子的良好配體;且金屬離子的吸電子作用可促進(jìn)酚羥基上的H游離。當(dāng)TP與金屬離子相遇時(shí),TP作為多基配體在其鄰位酚羥基上形成以金屬離子為中心的穩(wěn)定的茶多酚金屬絡(luò)合物[3-5]。茶多酚形成金屬絡(luò)合物后其生物活性會(huì)受到影響,有研究表明TP-Zn絡(luò)合物對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基及羥基自由基的清除能力均強(qiáng)于TP[6]。

金屬離子與TP絡(luò)合對(duì)TP生物活性的影響,特別是對(duì)其抑菌活性的影響引起了人們的廣泛關(guān)注。研究表明,TP-Zn絡(luò)合物對(duì)多種口腔致病菌的抑菌活性均高于TP,TP-Cu絡(luò)合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率與TP相比提高了27.6%,TP-Zn絡(luò)合物對(duì)大腸桿菌的抑菌率與TP相比提高了46.2%等[7-9]?？梢?茶多酚金屬絡(luò)合物有作為一類安全高效天然抑菌劑應(yīng)用的潛能。然而,由于可與茶多酚絡(luò)合的金屬離子種類繁多,不同茶多酚金屬絡(luò)合物的抑菌活性不同,且有些金屬離子毒性大、價(jià)格高、或與茶多酚絡(luò)合所需條件高等原因[10],有必要對(duì)茶多酚金屬絡(luò)合物的制備及其抑菌活性展開系統(tǒng)的研究。

本文擬以茶多酚鎘(TP-Cd)絡(luò)合物的制備工藝為研究對(duì)象,確定TP-Cd絡(luò)合物最佳制備工藝并制備12種不同茶多酚金屬絡(luò)合物;在此基礎(chǔ)上,研究這些絡(luò)合物對(duì)金黃色葡萄球菌和軟腐病菌的抑菌效果,對(duì)茶多酚金屬絡(luò)合物的抑菌活性進(jìn)行評(píng)估,以期為茶多酚金屬絡(luò)合物在微生物防治等方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ATCC6538金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 廣東省微生物菌種保藏中心;軟腐病菌(Rhizopusstolonifera) 從典型的桃軟腐病果果實(shí)上分離、純化、鑒定,實(shí)驗(yàn)室保存；茶多酚 純度≥98%,安徽紅星藥業(yè)股份有限公司;其他試劑 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

AUW220D型電子分析天平 日本島津制作所;DW-2型增力無極恒速攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;LD5-10型離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;MS2000型紫外可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;IS-RDD3型臺(tái)式恒溫?fù)u床 美國Crystal公司;SPL-259型生化培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TP-Cd絡(luò)合物的制備工藝

1.2.1.1 工藝流程 茶多酚與氯化鎘溶液→均勻混合→NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH→1000 r/min勻速攪拌→4200 r/min離心10 min→去離子水、乙醇、丙酮依次洗滌→收集沉淀→-80 ℃冷凍干燥→TP-Cd絡(luò)合物

1.2.1.2 制備條件的篩選 根據(jù)上述工藝流程,稱取TP和氯化鎘分別溶解于250 mL水中,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察制備條件中各因素變量對(duì)茶多酚沉淀率的影響。TP-Cd絡(luò)合物的制備條件為:固定反應(yīng)條件為TP/Cd2+摩爾比1∶3,反應(yīng)溫度30 ℃,反應(yīng)時(shí)間30 min,考察pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)對(duì)茶多酚沉淀率的影響;固定反應(yīng)條件為TP/Cd2+摩爾比1∶3,pH為6.5,反應(yīng)時(shí)間30 min,考察反應(yīng)溫度(10、20、30、40、50 ℃)對(duì)茶多酚沉淀率的影響;固定反應(yīng)條件為TP/Cd2+摩爾比1∶3,pH為6.5,反應(yīng)溫度30 ℃,考察反應(yīng)時(shí)間(10、20、30、40、50 min)對(duì)茶多酚沉淀率的影響;固定反應(yīng)條件為pH為6.5,反應(yīng)溫度30 ℃,反應(yīng)時(shí)間30 min,考察TP/Cd2+摩爾比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)對(duì)茶多酚沉淀率的影響。

采用酒石酸亞鐵比色法測(cè)定上清液中殘余茶多酚的含量[11],按下式計(jì)算茶多酚沉淀率:

茶多酚沉淀率(%)=(1-上清液中茶多酚的含量/原液中茶多酚的含量)×100

1.2.1.3 最佳條件的優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇TP/Cd2+摩爾比、pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間為考察因素,采用正交表L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。以茶多酚沉淀率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.2 茶多酚金屬絡(luò)合物的制備 在1.2.1的基礎(chǔ)上,分別探究TP-Cu、TP-Zn、TP-Mn、TP-Pb、TP-Fe(Ⅲ)、TP-Al、TP-Se、TP-K、TP-W、TP-Cr、TP-Ca絡(luò)合物的制備工藝,并分別制備茶多酚金屬絡(luò)合物。

1.2.3 茶多酚金屬絡(luò)合物的抑菌活性

1.2.3.1 培養(yǎng)基的組成 甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g,牛肉膏1 g,氯化鈉75 g,甘露醇10 g,酚磺肽0.025 g,瓊脂14 g);PDA培養(yǎng)基(土豆200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15～20 g)

1.2.3.2 菌種活化與培養(yǎng) 刮取培養(yǎng)基上少數(shù)金黃色葡萄球菌菌落,轉(zhuǎn)接于甘露醇氯化鈉液體培養(yǎng)基中,置于恒溫?fù)u床37 ℃、180 r/min培養(yǎng)16 h,重復(fù)3次。取已活化的菌液100 μL,平板菌落計(jì)數(shù)法調(diào)整菌落濃度[12],4 ℃保存,備用。

圖1 反應(yīng)條件對(duì)茶多酚沉淀率的影響

取預(yù)先保存的軟腐病菌,在邊緣生長(zhǎng)旺盛處,用打孔器打直徑為1.0 cm的菌餅,將有菌絲一面向下接種到PDA培養(yǎng)基中央,28 ℃培養(yǎng)24 h,重復(fù)3次。

1.2.3.3 對(duì)金黃色葡萄球菌增殖的影響 分別稱取一定量的TP和茶多酚金屬絡(luò)合物,紫外殺菌30 min后,充分溶于無菌水中,按倍半稀釋法配制成濃度梯度為0.8～0.0015625 mg/mL的溶液。吸取金黃色葡萄球菌菌液100 μL,依次接種于1.0 mL不同濃度的樣品溶液中,無菌水為對(duì)照,37 ℃、180 r/min作用4.0 h后,分別取樣品液100 μL,均勻涂布在甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基上,37 ℃,倒置培養(yǎng)24.0 h,計(jì)數(shù),計(jì)算抑菌率[13-14]。

1.2.3.4 對(duì)軟腐病菌增殖的影響 分別稱取一定量的TP和茶多酚金屬絡(luò)合物,紫外殺菌30 min后,充分溶于無菌水中,配制成濃度為8.0和4.0 mg/mL的溶液。取稀釋后的溶液1.0 mL,與9.0 mL的PDA培養(yǎng)基混合,無菌水為對(duì)照,制成含樣培養(yǎng)基。

取預(yù)先活化好的軟腐病菌,在邊緣生長(zhǎng)旺盛處,用打孔器打直徑為1.0 cm的菌餅,將有菌絲一面向下轉(zhuǎn)移到含樣培養(yǎng)基中央,28 ℃培養(yǎng)至對(duì)照長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿邊緣或不再生長(zhǎng)時(shí),測(cè)量菌絲直徑,計(jì)算抑菌率[15]。

抑菌率(%)=[1-(處理菌絲生長(zhǎng)直徑-菌餅直徑)/(對(duì)照菌絲生長(zhǎng)直徑-菌餅直徑)]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 TP-Cd絡(luò)合物的制備工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和TP/Cd2+摩爾比對(duì)茶多酚沉淀率的影響如圖1所示。

結(jié)果表明,隨溶液pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和TP/Cd2+摩爾比的變化,茶多酚沉淀率均呈先升高后降低的趨勢(shì)。pH對(duì)茶多酚沉淀率的影響較大。TP在酸性環(huán)境下比較穩(wěn)定,但與金屬離子的絡(luò)合能力較差;當(dāng)環(huán)境pH逐漸趨于堿性時(shí),TP的反應(yīng)活性提高,茶多酚沉淀率逐漸達(dá)到最大;此時(shí)再提高溶液的pH,TP容易失去其結(jié)構(gòu)中的酚羥基配體,氧化成醌類化合物,導(dǎo)致茶多酚沉淀率降低[16]。TP/Cd2+摩爾比也是影響茶多酚沉淀率的一個(gè)重要因素。TP/Cd2+摩爾比達(dá)到1∶1之前,溶液中的TP沉淀未達(dá)到飽和,隨著Cd2+濃度的增加,茶多酚沉淀率逐漸增大;當(dāng)TP/Cd2+摩爾比為1∶1時(shí),茶多酚沉淀率達(dá)到最大。由于Cd2+與TP絡(luò)合有其特定的配位數(shù),沉淀已達(dá)到飽和狀態(tài),過量的Cd2+不僅不再與TP發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),還可能引起TP的氧化,使其失去絡(luò)合能力[17];故此時(shí)繼續(xù)增加氯化鎘的用量,茶多酚沉淀率不再升高。除此之外,隨著反應(yīng)溫度的升高和反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),分子擴(kuò)散速度增快,有效地促進(jìn)了TP的沉淀;但隨著溫度和時(shí)間的持續(xù)增加,TP逐漸發(fā)生氧化,茶多酚沉淀率下降。綜合考慮成本、能耗等因素,制備條件以TP/Cd2+摩爾比1∶1、pH6.5,30 ℃下作用30 min為宜。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,表明4種因素均顯著影響茶多酚沉淀率,其影響程度為TP/Cd2+摩爾比(A)>pH(B)>反應(yīng)溫度(C)>反應(yīng)時(shí)間(D),最優(yōu)水平組合為A1B2C2D3,即制備TP-Cd絡(luò)合物的最優(yōu)條件為:TP/Cd2+摩爾比為1∶1,反應(yīng)pH為6.5,反應(yīng)溫度30 ℃,反應(yīng)時(shí)間30 min;在此條件下,茶多酚沉淀率為93.91%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 不同茶多酚金屬絡(luò)合物的制備

分別在其最優(yōu)條件下制備了12種茶多酚金屬絡(luò)合物。

由表3可知不同茶多酚金屬絡(luò)合物粉末顏色不同,其中,TP-Cu、TP-Se、TP-Fe(Ⅲ)絡(luò)合物以黑色為主,TP-Zn、TP-Mn、TP-Cr絡(luò)合物以黃色為主,其余的以棕褐色為主;TP-Al、TP-Fe(Ⅲ)絡(luò)合物有金屬光澤,TP-W絡(luò)合物略帶金屬光澤。

表3 茶多酚金屬絡(luò)合物的顏色

2.3 茶多酚金屬絡(luò)合物對(duì)金黃色葡萄球菌的影響

表4結(jié)果表明,除TP-Se和TP-K絡(luò)合物外,與TP相比,其他茶多酚金屬絡(luò)合物的抑菌活性均顯著增強(qiáng)。大多數(shù)金屬離子與配體絡(luò)合后,對(duì)配體的生物活性具有明顯的增強(qiáng)效應(yīng),這與目前已有的一些研究結(jié)果是一致的[18]。在此結(jié)果的基礎(chǔ)上,對(duì)抑菌活性較好的TP-Cu、TP-Zn、TP-Mn、TP-Cd和TP-Pb絡(luò)合物進(jìn)行進(jìn)一步地研究。由表5可看出這5種茶多酚金屬絡(luò)合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性有顯著性差異(P<0.05),且具有濃度依賴性,其中,TP-Cu絡(luò)合物的抑菌活性最強(qiáng);TP-Cd絡(luò)合物在高濃度下抑菌活性較強(qiáng),在低濃度下抑菌活性喪失較快。綜合研究結(jié)果可知,茶多酚金屬絡(luò)合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性為:TP-Cu>TP-Cd>TP-Zn>TP-Pb>TP-Mn>TP-W≈TP-Al>TP-Fe(Ⅲ)>TP-Cr≈TP-Ca>TP>TP-K>TP-Se。

表4 茶多酚金屬絡(luò)合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

表5 茶多酚金屬絡(luò)合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率

2.4 茶多酚金屬絡(luò)合物對(duì)軟腐病菌的影響

表6結(jié)果表明,不同的金屬離子與TP絡(luò)合后,對(duì)TP抑菌活性的影響存在顯著差異。TP與Cu2+、Cd2+、Zn2+、Se4+、Mn2+絡(luò)合后對(duì)軟腐病菌的抑菌活性顯著提升,而與Pb2+、Cr2+絡(luò)合則使抑菌活性完全喪失。TP及茶多酚金屬絡(luò)合物對(duì)軟腐病菌的抑菌活性為:TP-Cu≈TP-Cd>TP-Zn>TP-Se>TP-Mn>TP-W>TP-Ca>TP>TP-Al>TP-K>TP-Fe(Ⅲ)>TP-Pb>TP-Cr。

表6 茶多酚金屬絡(luò)合物對(duì)軟腐病菌的抑菌率

研究普遍認(rèn)為,TP對(duì)細(xì)菌和真菌的抑菌作用是通過抑制菌體與菌絲的生長(zhǎng)、破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的形成、改變菌體的正常形態(tài)、進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)生物大分子的功能表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的[19]。TP與金屬離子絡(luò)合后,分子的共軛效應(yīng)增強(qiáng),使得絡(luò)合物與細(xì)菌細(xì)胞中DNA、蛋白質(zhì)等的結(jié)合能力增強(qiáng),從而導(dǎo)致抑菌活性增強(qiáng)[20-21]。不僅如此,金屬離子本身具有一定的抑菌活性,TP與金屬離子絡(luò)合后可能產(chǎn)生了協(xié)同增效作用,從而增強(qiáng)其抑菌活性。不同的金屬離子與TP絡(luò)合后形成的絡(luò)合物在結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性上必然存在一定的差異,進(jìn)而影響它們與細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)生物大分子的結(jié)合和破壞能力[22-24],從而導(dǎo)致它們抑菌活性的不同。

研究還表明茶多酚金屬絡(luò)合物對(duì)真菌的抑菌活性顯著低于細(xì)菌,這與TP對(duì)細(xì)菌的抑菌活性強(qiáng)于真菌的研究報(bào)道一致[25]。這可能是由于真菌和細(xì)菌在細(xì)胞壁組成成分上的差異影響了TP及茶多酚金屬絡(luò)合物對(duì)它們的親和力和穿透力,進(jìn)而影響了抑菌活性，且金屬離子在細(xì)胞內(nèi)酶的催化反應(yīng)中的作用也各不相同,這些均可能影響茶多酚金屬絡(luò)合物對(duì)微生物生長(zhǎng)和繁殖的作用[26]。

3 結(jié)論

茶多酚可與金屬離子絡(luò)合形成穩(wěn)定的茶多酚金屬絡(luò)合物,以TP-Cd為代表,其最優(yōu)制備工藝為:TP/Cd2+摩爾比為1∶1,反應(yīng)pH為6.5,反應(yīng)溫度30 ℃,反應(yīng)時(shí)間30 min;不同茶多酚金屬絡(luò)合物的抑菌活性存在一定差異,但從整體來看,大多數(shù)茶多酚金屬絡(luò)合物的抑菌活性顯著優(yōu)于TP,其中,TP-Cu、TP-Cd和TP-Zn對(duì)細(xì)菌和真菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用,抑菌活性最強(qiáng)。TP-Cu、TP-Cd和TP-Zn等絡(luò)合物不僅制備工藝簡(jiǎn)單,能顯著(P<0.05)增強(qiáng)TP的抑菌活性,還能有效降低重金屬離子的毒副作用，但研究發(fā)現(xiàn)其存在溶解性差等問題,這為其研發(fā)和實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用帶來了不便,需要通過進(jìn)一步地研究解決。此外,為了明確其作用機(jī)理和實(shí)際利用價(jià)值,茶多酚金屬絡(luò)合物的長(zhǎng)效抑菌作用、詳盡的抑菌機(jī)理及其對(duì)人體是否具有毒副作用都需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。但總體來說,茶多酚金屬絡(luò)合物,尤其是TP-Cu、TP-Cd和TP-Zn等絡(luò)合物,具有進(jìn)一步研究并開發(fā)成為新型抑菌劑的潛能;該研究不僅為茶資源的綜合利用提供了新的思路,也為天然產(chǎn)物在微生物防治方面的研究、開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。