常偉偉，彭輝，胡冰潔

（山東理工大學(xué)分析測試中心，山東淄博，255049）

0 引 言

蛋白質(zhì)是奶粉中重要的營養(yǎng)成分[1-2]。蛋白質(zhì)含量是衡量奶粉營養(yǎng)價值的重要指標之一。由于蛋白質(zhì)是非常復(fù)雜的有機大分子，目前還沒有直接測定方法[3-4]。最常用的測定蛋白質(zhì)含量的方法為凱氏定氮法[5-6]，需要經(jīng)過硝化、蒸餾、滴定等步驟，才能測定出氮含量，測定的氮含量乘以換算系數(shù)6.38（參照國標GB5009.5-2016）[7]，從而計算出粗蛋白的含量。但該方法操作繁瑣，費時費力。而且使用大量溶劑，造成溶劑浪費和環(huán)境污染，并且還會產(chǎn)生有毒氣體，如果操作不當(dāng)，還會對操作者的身體造成一定程度的損害。

元素分析儀是20 世紀60 年代出現(xiàn)的，1960 年以后，隨著物化分析及電子技術(shù)的飛速發(fā)展，元素分析儀的自動化也日趨成熟。近年來，元素分析法廣泛應(yīng)用于化工產(chǎn)品、食品及藥品中有機元素C、H、N、S、O的定量分析[8-11]。元素分析法測定N 元素含量的原理是依據(jù)杜馬定氮法[12]，樣品在高溫下，氧氣助燃條件下燃燒，N 元素轉(zhuǎn)變?yōu)镹2和氮氧化物被高純載氣帶到還原管，被還原銅還原后，全部轉(zhuǎn)變?yōu)镹2，最后被載氣吹到檢測器，通過測量含氮載氣和純載氣的信號差，得出氮的含量。氮含量乘以換算系數(shù)可以計算出蛋白質(zhì)的含量。元素分析法具有操作簡便、樣品用量少、準確、快速等優(yōu)點。近年來，采用元素分析法測定N元素含量，以間接測定食品中蛋白質(zhì)的研究也日益增加。如：鐘虹敏等[13]分別用元素分析法和凱氏定氮法測了16 種粉狀食品中蛋白質(zhì)的含量，兩種方法測定的結(jié)果相近。蔡紅燕等[14]的研究表明元素分析法測定面粉中粗蛋白含量，比凱氏定氮法準確度和精密度高。由此可見，元素分析法可以作為凱氏定氮法的替代和補充方法，是測定食品中蛋白質(zhì)含量的一種簡便、準確的檢測方法。

測量不確定度是表征合理賦值與被測值（真值）的分散性與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)[15]，測量不確定度的大小反映了測量結(jié)果的可信程度。因此為了說明測量結(jié)果的質(zhì)量，必須評定測量不確定度。通過測量不確定度的評定，還可以知道各種測量誤差對不確定度分量的貢獻[16]，從而控制對測量不確定度貢獻較大的分量，確保測量結(jié)果的質(zhì)量符合規(guī)定的用途。本文用元素分析法測定了11 種成人及嬰幼兒奶粉中的蛋白質(zhì)含量，并以實例對元素分析法測定N 含量的不確定度進行了評定，為更系統(tǒng)合理的評定元素分析法測定蛋白質(zhì)含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與材料

元素分析儀（帶80 位自動進樣器）Vario EL cube，德國Elementar 公司；XP6 型微量電子天平，分度值0.001 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

對氨基苯磺酰胺標準物質(zhì)（sulfanilamide,C6H8N2O2S）N: 16.25%，德國 Elementar 公司；測試樣品：11 種成人及嬰幼兒奶粉（見表1），市售；錫舟4×4×11 mm，德國Elementar公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗條件

CHNS 模式: 燃燒管溫度: 1 150 ℃; 還原管溫度:850 ℃; TCD 溫度：60 ℃ 。載氣：高純 He 氣（體積分數(shù)≥99.999%），流速：120 mL/min，工作壓力：0.0110～0.0115 MPa; 助燃氣：高純O（2體積分數(shù)≥99.999%），氧氣的減壓閥調(diào)節(jié)為0.22 MPa。

1.2.2 實驗步驟

（1）儀器開機，打開軟件，選擇模式為CHNS 模式，檢漏完成后，設(shè)定燃燒管溫度: 1 150 ℃; 還原管溫度: 850 ℃，TCD 溫度：60 ℃，升溫至各溫度達到工作溫度。

（2）先做 n 個空白實驗，至C、H、N、S 的空白峰積分面積小于100。

（3）用微量電子天平精確稱量2～3 mg 對氨基苯磺酰胺標準物質(zhì)，用錫舟包好壓實。平行2～3 個Run in（對氨基苯磺酰胺標準物質(zhì)）以使系統(tǒng)達到平衡，系統(tǒng)穩(wěn)定后，再測量3 次平行的對氨基苯磺酰胺標準物質(zhì)，計算日校正因子。

（4）用微量電子天平精確稱量2～3 mg 待測樣品，用錫舟包好壓實，依次放到自動進樣器對應(yīng)的位置。每個樣品做3 次平行。每測試20 個樣品后，重復(fù)測量兩次標準物質(zhì)。

（5）全部測試完成后，降溫，待燃燒管和還原管降到100 ℃以下后，關(guān)閉氦氣和氧氣，關(guān)閉軟件，關(guān)閉主機。

2 結(jié)果與討論

2.1 測定結(jié)果的準確度和方法精密度考察

采用元素分析法對11 種奶粉中蛋白質(zhì)含量進行測定，每個樣品均重復(fù)測定3 次。測定結(jié)果見表1。從表1 中的實驗數(shù)據(jù)可以看出，蛋白質(zhì)測定值與產(chǎn)品標示值基本一致，相對誤差小于7.2%，符合蛋白質(zhì)測定要求。重復(fù)3次測定結(jié)果的相對標準偏差（RSD）均小于0.36%，說明元素分析法測定蛋白質(zhì)含量的精密度良好。

2.2 測定不確定性評估

以荷蘭乳牛（中老年脫脂高鈣益生菌）奶粉為例，對N 含量測定結(jié)果的不確定度進行了評定。

2.2.1 建立測量數(shù)學(xué)模型

奶粉中N 元素的含量的測量數(shù)學(xué)模型為：

式（2），（3）中：x 為元素分析儀測得的標準物質(zhì)（對氨基苯磺酰胺）中N 元素的絕對峰面積；y 為標準物質(zhì)中N 元素的絕對質(zhì)量（mg）；a 為校準曲線的斜率；b為校準曲線的截距。

2.2.2 不確定度的來源

由式（1）（3）可繪制氮元素測定的因果關(guān)系圖（圖1），由圖1 可見測量N 元素含量的不確定度的來源主要包括：稱量過程產(chǎn)生的不確定度、對氨基苯磺酰胺標準物質(zhì)的不確定度、工作曲線擬合的不確定度及測量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度。

表1 元素分析法測定奶粉中蛋白質(zhì)含量（n=3）

圖1 氮元素含量測定的因果關(guān)系圖

2.2.3 不確定度評定

不確定度的評定區(qū)分為A 類評定和B 類評定[17]。A 類不確定度評定是通過對規(guī)定測量條件下獲得的測量值的統(tǒng)計分析評定測量不確定度分量。B 類不確定度是根據(jù)經(jīng)驗和資料及假設(shè)的概率分布估計的標準偏差表征，只能用非統(tǒng)計分析的方法進行評定。

（1）稱量過程產(chǎn)生的不確定度um

樣品的質(zhì)量的不確定度是由稱量過程帶來的。樣品的質(zhì)量m，實際上是用配衡體稱量法通過2 次稱量所得，即有一次去皮（回零）所得：

式中：m皮=m1：沒有裝樣品時空錫舟的質(zhì)量（mg）；m總=m2：樣品與錫舟總質(zhì)量（mg）。

（a）沒有裝樣品的空錫舟質(zhì)量m1的不確定度u（m1）評定

m1的不確定度來自兩方面：第一，由天平稱量不準引入的標準不確定度uB1（m1），按B 類方法評定；第二，天平分辨力引入的標準不確定度uB2（m1），也是按B 類方法評定。

在本實驗中使用的電子天平的最大允許誤差±0.001 mg，服從均勻分布，則包含區(qū)間半寬度am01=0.001 mg，包含因子由此引起的不確定度uB1（m1）為

由天平說明書可知其分辨力為0.001 mg，服從均勻分布，區(qū)間半寬度am02=0.0005 mg，包含因子km02=由此引起的標準不確定度uB（2m1）為：

則m1稱量的合成標準不確定度

(b) 質(zhì)量m2的不確定度 u（m2）評定

質(zhì)量m2的標準不確定度的評定與質(zhì)量m1的標準不確定度評定方法相同。因此質(zhì)量m2的標準不確定度分量u（m2）為：

(c) 質(zhì)量m 的不確定度um評定

質(zhì)量m1和m2是用同一臺電子天平測量的，是相關(guān)量。但是m 是m1和m2差值，其系統(tǒng)偏差被抵消，m 的不確定度采用方和根的方法進行合成，即：

（2）標準物質(zhì)的不確定度us

標準物質(zhì)產(chǎn)生的不確定度屬于B 類不確定度，本實驗使用的標準物質(zhì)對氨基苯磺酰胺按照標準物質(zhì)證書上給出的N 元素百分含量wstd=16.25% ± 0.04%，由于沒有關(guān)于不確定度的其他說明，按均勻分布處理，其區(qū)間半寬度astd= 0.04%，則由標準物質(zhì)對氨基苯磺酰胺引起的N 元素的不確定度為：

（3）工作曲線擬合的不確定度uw

本次校準采用一次線性方程式(2)：y=ax+b，另外，證書中標準物質(zhì)對氨基苯磺酰胺的N 元素百分含量為16.25%，對氨基苯磺酰胺中N 元素絕對質(zhì)量y 還可以通過N 元素百分含量乘以稱量質(zhì)量mstdi得到，即：

式中mstdi為i 次稱量的標準物質(zhì)質(zhì)量；wstd為標準物質(zhì)中N 元素的百分含量（16.25%）。

在日常分析中，需要用標準物質(zhì)測得的日校正因子f 對校準曲線進行調(diào)整。f 是日常測試標準物質(zhì)后，理論值wthe與日常測試值wact之比，即

因此，計算實際樣品中N 元素的絕對質(zhì)量時，實際使用的校準曲線為式（3）：y=f×(ax+b)。

通過測量一系列的標準物質(zhì)xstdi，繪制標準方程為：

式中yi是標準物質(zhì)對于xi的用式（13）計算得到的值，為x=xi時用式（16）計算得到的值；n 為繪制標準曲線的實驗點數(shù)（n=20）。

本次實驗對樣品荷蘭乳牛（中老年脫脂高鈣益生菌）奶粉進行了10 次測量，以式（3）為定量依據(jù)，得到樣品中N 元素的絕對質(zhì)量y0。最小二乘法擬合標準曲線校準得出x0時，所產(chǎn)生的的標準不確定度：

式(18)-(20)中，i 為測試編號；絕對質(zhì)量的平均值；繪制標準曲線所用全部 ystdi的平均值；為全部xstdi的平均值；a 為校準曲線的斜率（a=3.059×10-5）；b 為校準曲線的截距(b=9.212×10-4)；p 為樣品測試次數(shù)（p=10）；n為繪制標準曲線的實驗點數(shù)（n=20）；日校準因子f=1.009。

由校準曲線引起的相對不確定度uw,rel為：

（4）測量重復(fù)性引起的不確定度ur

在相同條件下，稱取10 份荷蘭乳牛（中老年脫脂高鈣益生菌）奶粉，進行N 元素含量測定（測定結(jié)果見表2），測量重復(fù)性引起的不確定度屬于A 類不確定度，可以用統(tǒng)計方法計算其不確定度。因此，由測量重復(fù)性帶來的不確定性ur為：

其中，sr為樣品測量結(jié)果的標準偏差；p 為樣品的測量次數(shù)（p=10）。

wN為測量的樣品奶粉中N 元素百分含量的平均值。計算結(jié)果見表2。

（5）測定奶粉中N 含量的合成標準不確定度uc

以荷蘭乳牛（中老年脫脂高鈣益生菌）奶粉為例，采用元素分析儀測定奶粉中N 元素含量的相對合成不確定度為：

將有關(guān)數(shù)據(jù)代入公式（24）可以得出N 元素的合成標準不確定度，見表3。

（6）測定奶粉中N 含量的擴展不確定度UN

擴展不確定度是用來評判測量方法或測量結(jié)果是否值得相信的量化參數(shù)。相對擴展不確定度用合成標準不確定度乘以一個大于1 的包含因子（k）表示，置信（包含）水平P 為95%時，取包含因子k=2, N 元素含量的相對擴展不確定度為：

表2 測量重復(fù)性引起的標準不確定度分量

表3 元素分析法測定荷蘭乳牛奶粉中N元素含量的不確定度評定結(jié)果

采用元素分析法測定荷蘭乳牛奶粉的N 元素含量的擴展不確定度為：

則本實驗中所測荷蘭乳牛（中老年脫脂高鈣益生菌）奶粉中N 元素含量及不確定度表示為(3.560 ±0.15)%，k=2, 置信水平P=95%

3 結(jié) 論

采用元素分析法測定了11 種奶粉中蛋白質(zhì)含量，測量結(jié)果表現(xiàn)出很好的準確度和精密度。并以荷蘭乳牛（中老年脫脂高鈣益生菌）奶粉為例，評定了元素分析儀測定N 元素含量的不確定度，不確定度主要來源于標準曲線擬合，其他不確定度貢獻從大到小依次為測量重復(fù)性、標準物質(zhì)、及稱量過程。元素分析儀測定N 元素含量的擴展不確定度為0.15%（k=2, 置信水平P=95%）。在使用元素分析儀測試元素含量時，選用元素含量與待測物含量盡可能接近的校準物質(zhì)、增加標準曲線中的實驗點數(shù)、使用誤差小的天平等有助于減小不確定度，增加測試結(jié)果的可信度。