張金芳，劉夢思，孫秀玉，劉立亞，李志勇，黃秀蘭

（中央民族大學1.藥學院，2.生命與環(huán)境科學學院，北京 100081）

據(jù)《中國心血管病報告2018》報道，冠心病患病率和死亡率持續(xù)升高，在心腦血管疾病中僅次于卒中［1］。心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是由冠狀動脈完全或局部閉塞后，血液供需失衡，在一定時間內(nèi)恢復灌注致使心肌損傷加重的病理過程［2］。目前，自噬在MIRI的發(fā)生發(fā)展過程中越來越受到關注，其調(diào)控機制可能與自噬的狀態(tài)有關［3］。自噬包括自噬體形成、自噬體與溶酶體融合和自噬溶酶體降解3個階段［4］。目前認為心肌缺血時自噬可減少心肌細胞死亡，對心肌具有保護作用；再灌注時，自噬加重心肌細胞損傷，其機制是自噬過度還是自噬流受阻則存在著爭議［3，5-6］。另有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠MIRI可激活細胞自噬，不同缺血時間和不同再灌注時間導致自噬的狀態(tài)不同［7］。可見，MIRI過程中自噬的改變值得深入研究。

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種存在于花生、葡萄和中藥虎杖等植物中的多酚化合物，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等藥理活性，主要用于防治心血管疾病、糖尿病、高血壓和腎疾病等［8］。研究表明，Res可通過調(diào)控自噬減輕MIRI，目前尚不清楚其機制是否與自噬的改變有關［9］。本研究通過體外培養(yǎng)乳大鼠心肌細胞，制備心肌細胞低氧復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷模型同時加用自噬抑制劑氯喹（chloroquine，CQ），以探討Res對H/R損傷心肌細胞的保護作用和機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

Res（純度＞99%，長沙康隆生物制品有限公司贈予）；CQ和5-BrdU（美國Sigma公司）；青、鏈霉素和DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Corning公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；兔抗大鼠P62多克隆抗體（美國Abcam公司）；兔抗大鼠β肌動蛋白單克隆抗體和兔抗大鼠Beclin 1單抗（美國CST公司）；兔抗大鼠微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule associated protein light chain 3，LC3）多抗（美國Invitrogen公司）；FITC標記的山羊抗兔IgG抗體（美國Millipore公司）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒和CCK-8試劑盒（日本株式會社東仁化學研究所）；AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）。

三氣培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（德國Binder公司）；倒置相差顯微鏡和倒置熒光顯微鏡（日本Olympus株式會社）；垂直板電泳槽（北京六一生物技術有限公司）；濕式轉(zhuǎn)移電泳槽（美國Bio-Rad公司）；化學發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司）；多功能酶標儀和流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 動物和原代心肌細胞制備培養(yǎng)

出生24 h內(nèi)SPF級SD乳大鼠，實驗動物使用許可證：SCXK-（軍）0007-004（軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心）。按文獻［10］分離乳大鼠心肌細胞，接種于含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置CO2細胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）中培養(yǎng)。待細胞融合度約80%時，用于實驗。

1.3 心肌細胞H/R損傷模型制備

心肌細胞常規(guī)用含10%胎牛血清的DMEM/F12的培養(yǎng)基培養(yǎng)。低氧處理時，換用三氣培養(yǎng)箱中預飽合1 h的Hank液，置于三氣培養(yǎng)箱（94% N2，5% CO2，1% O2）中培養(yǎng)12 h，復氧處理時，換成常規(guī)培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.4 細胞分組和處理

乳大鼠心肌細胞分為5組：細胞對照組，常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；H/R模型組，常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后低氧12 h，復氧12 h；模型+Res 5 和 20 μmol·L-1組，Res 5 和20 μmol·L-1預處理細胞12 h，然后低氧12 h，復氧12 h；模型+Res 20 μmol·L-1+CQ 10 μmol·L-1組，Res 20 μmol·L-1預處理細胞12 h，然后換含終濃度為CQ 10 μmol·L-1的 Hank液低氧培養(yǎng)12 h，再換用終濃度為CQ 10 μmol·L-1復氧12 h。

1.5 CCK-8法測定心肌細胞存活率

將心肌細胞5×108L-1接種于96孔板，每孔100 μL，每組設6復孔，按1.5分組處理細胞H/R結(jié)束后，加入CCK-8溶液置于CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標儀在450 nm處檢測吸光度值（A450nm），計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（給藥組A450nm-空白組A450nm）/（細胞對照組A450nm-空白組A450nm）×100%。

1.6 比色法測定心肌細胞LDH漏出率

密度為5×108L-1心肌細胞接種于96孔板，每孔100 μL，每組設6復孔，按1.5分組處理細胞。H/R結(jié)束后，按LDH試劑盒說明書操作，同時設不經(jīng)藥物處理的高對照組（含培養(yǎng)基、細胞懸液和裂解緩沖液）和低對照組（含培養(yǎng)基和細胞懸液）。用酶標儀測定490 nm處的吸光度值（A490nm），計算LDH漏出率。LDH漏出率（%）=（樣品A490nm-低對照A490nm）/（高對照A490nm-低對照A490nm）×100%。

1.7 AnnexinⅤ/Pl雙染法檢測細胞凋亡

按照1.5分組處理細胞，H/R結(jié)束后，胰蛋白酶消化法收集細胞并調(diào)整密度，取細胞懸液100 μL，按AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒說明書操作，加AnnexinⅤ-FITC染色液5 μL避光孵育15 min，再加PI染色液5 μL，用結(jié)合緩沖液終止反應，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測分析。

1.8 免疫熒光法檢測心肌細胞LC3陽性細胞率

將密度為5×108L-1心肌細胞接種于激光共聚焦小皿，分別按1.5分組處理細胞，H/R結(jié)束后，4%多聚甲醛固定，0.2%Triton X-100室溫透化，5%BSA-PBS封閉2 h。兔抗大鼠LC3多抗（稀釋倍數(shù)為1∶200）4℃孵育過夜。FITC標記的羊抗兔IgG抗體（二抗，稀釋倍數(shù)為1∶500）于CO2培養(yǎng)箱中濕盒避光孵育1 h，室溫下DAPI避光孵育10 min，隨機選取5個高倍（400×）視野，計數(shù)心肌細胞總數(shù)和LC3陽性細胞數(shù)（細胞至少有5個LC3斑點），計算LC3陽性細胞率。LC3陽性細胞率（%）=LC3陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.9 Western印跡法檢測心肌細胞Beclin 1，LC3Ⅱ和P62蛋白表達水平

分別按1.5分組處理細胞，H/R結(jié)束后，加含蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA的裂解液，冰上裂解30 min后，9120×g，4℃離心20 min，提取細胞總蛋白。BCA法測定總蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗（抗Beclin 1、LC3和β肌動蛋白1∶1000稀釋，抗P62為1∶500稀釋）4℃孵育過夜，二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光液避光反應，用顯影儀拍照。采用Image J軟件分析條帶積分吸光度值，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度比值表示蛋白的相對表達水平。

1.10 統(tǒng)計學分析

用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，實驗重復3次。組間比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，方差齊時采用LSD（L）檢驗，方差不齊時采用TamhaneT2（M）檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Res對H/R損傷乳大鼠心肌細胞形態(tài)的影響

倒置相差顯微鏡觀察心肌細胞形態(tài)，細胞對照組心肌細胞融合度較高，細胞多呈梭形、三角形或星形，輪廓清晰且折光性強（圖1A）。H/R組細胞融合度明顯降低，細胞間隙較大，折光度低（圖1B）。H/R+Res 5 和20 μmol·L-1組心肌細胞生長狀態(tài)明顯改善，融合度升高，折光度增強（圖1C、圖1D）。H/R+Res 20 μmol·L-1加用 CQ 10 μmol·L-1后，細胞間隙增大，狀態(tài)與H/R組相似（圖1E）。

Fig.1 Effect of resveratrol（Res）on morphology of myocardial cells of newborn rats after hypoxia/reoxygenation（H/R）.Model+Res 5 and 20 μmol·L-1group：cardiomyocytes were pretreated with Res 5 and 20 μmol·L-1for 12 h，and then processed with hypoxia for 12 h，reoxygenation for 12 h.Model+Res 20 μmol·L-1+CQ 10 μmol·L-1group：after cardiomyocytes were pretreated with Res 20 μmol·L-1for 12 h，processed with Hank medium containing the final concentration of CQ 10 μmol·L-1 to H for 12 h，and then replaced conventional DMEM/F12 culture medium containing the final concentration of CQ 10 μmol·L-1to reoxygenation for 12 h.

2.2 Res對H/R損傷乳大鼠心肌細胞存活率和LDH漏出率的影響

與細胞對照組相比，H/R組心肌細胞存活率顯著下降（P＜0.01），LDH漏出率顯著升高（P＜0.01）；與H/R組比較，H/R+Res 5 和20 μmol·L-1組心肌細胞存活率顯著升高（P＜0.05），LDH漏出率顯著下降（P＜0.01）（表1）。與H/R+Res 20 μmol·L-1組比較，H/R+Res 20 μmol·L-1+CQ 10 μmol·L-1組的細胞存活率明顯降低（P＜0.05），LDH漏出率顯著升高（P＜0.01），接近H/R組水平。

Tab.1 Effect of Res on cell viability and leakage rate of lactate dehydrogenase（LDH）of myocardial cells of newborn rats after H/R

2.3 Res對H/R損傷乳大鼠心肌細胞凋亡率的影響

Fig.2 Effect of Res on myocardial cells apoptosis of newborn rats after H/R.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group； #P＜0.05，##P＜0.01，compared with H/R group；ΔP＜0.05，compared with H/R+Res 20 group.

與細胞對照組相比，H/R組細胞早期凋亡率和總凋亡率均顯著升高（P＜0.01）（圖2）。與H/R組相比，H/R+Res 5和20 μmol·L-1組細胞早期凋亡率和總凋亡率均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。與H/R+Res 20 μmol·L-1組比較，H/R+Res 20 μmol·L-1+CQ 10 μmol·L-1組細胞早期凋亡率明顯上升（P＜0.05），總凋亡率無明顯變化。

2.4 Res對H/R損傷乳大鼠心肌細胞內(nèi)LC3陽性細胞率的影響

與細胞對照組相比，H/R組心肌細胞的LC3熒光點聚集不明顯，LC3陽性細胞率無明顯變化（圖3）。與H/R組相比，H/R+Res 5和20 μmol·L-1組心肌細胞的LC3熒光點聚集較大、較亮，LC3陽性細胞率顯著增加（P＜0.05）；H/R+Res 20 μmol·L-1+CQ 10 μmol·L-1組LC3熒光點聚明顯多且亮，LC3陽性細胞率顯著增加（P＜0.01）。與H/R+Res 20 μmol·L-1組比較，H/R+Res 20 μmol·L-1+CQ 10 μmol·L-1組的LC3熒光點聚集更大、更亮；LC3陽性細胞率無明顯變化。

Fig.3 Effect of Res on C3 positive myocardial cells rate in myocardial cells of newborn rats after H/R by immunofluorescence.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.#P＜0.05，##P＜0.01，compared with H/R group.

2.5 Res對H/R損傷乳大鼠心肌細胞Beclin 1，LC3Ⅱ和P62蛋白表達水平的影響

如圖4所示，與細胞對照組相比，H/R組Beclin 1蛋白表達水平無明顯變化；LC3Ⅱ和P62表達蛋白水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。與H/R組相比，H/R+Res 5和20 μmol·L-1組Beclin 1，LC3Ⅱ和P62蛋白表達水平均顯著上調(diào)（P＜0.05）；H/R+Res 20 μmol·L-1+CQ 10 μmol·L-1組Beclin 1 無明顯變化，LC3Ⅱ和P62蛋白表達水平均顯著上調(diào)（P＜0.01）。與 H/R+Res 20 μmol·L-1組比較，H/R+Res 20 μmol·L-1+CQ 10 μmol·L-1組Beclin 1蛋白表達水平下調(diào)，LC3Ⅱ和P62蛋白表達水平無明顯變化。

Fig.4 Effect of Res on protein expressions of Beclin 1，LC3Ⅱand P62 in myocardial cells of newborn rats after H/R by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with H/R group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，經(jīng)Res預處理后，H/R損傷心肌細胞的細胞活力升高，LDH漏出率下降，凋亡率降低，而加用CQ后，上述結(jié)果呈相反現(xiàn)象，提示Res對H/R損傷的心肌細胞具有保護作用，并推測Res對心肌細胞的保護作用可能與自噬有關。

自噬在MIRI中發(fā)揮重要作用，MIRI的機制可能與自噬的改變有關［11］。自噬是細胞清除受損或老化的細胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)，以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的適應性機制，其動態(tài)過程又稱為自噬流［4］。Beclin 1是自噬啟動的標志蛋白，自噬標志蛋白LC3存在于自噬的整個過程中，P62表達降低可能預示著自噬溶酶體的降解順暢，因此Beclin 1，LC3和P62是目前公認的反映自噬的重要蛋白［12］。自噬被激活后，胞漿內(nèi)的LC3Ⅰ脂化成為位于自噬體膜上的LC3Ⅱ，LC3Ⅱ和自噬小泡結(jié)合形成自噬體［13］。自噬底物蛋白P62和LC3Ⅱ相互作用形成自噬溶酶體并在自噬后期降解，而缺少Atg基因或自噬體與溶酶體的融合過程受到阻礙，均會使P62堆積，因此通過檢測P62的表達量來監(jiān)測自噬的變化［13-14］。CQ可升高溶酶體內(nèi)pH，降低溶酶體酶活性，不利于自噬體與溶酶體融合，阻礙自噬溶酶體的形成，從而抑制自噬，常用作評價自噬的工具藥［15］。由于LC3Ⅱ水平升高存在2種情況，即可能是自噬被激活引起自噬體增多也可能是自噬體與溶酶體融合受阻或自噬溶酶體降解受阻，因此需要加用CQ，進一步明確細胞內(nèi)自噬的狀態(tài)［16］。研究發(fā)現(xiàn)，單純低氧和不同時間H/R的大鼠心肌細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平均顯著提高，單純低氧能激活自噬，H/R則進一步激活自噬，且H/R會加重低氧引起的細胞損傷［17］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心肌細胞H/R損傷后引起B(yǎng)eclin 1表達升高，LC3Ⅱ和P62表達下降，表明H/R可能通過抑制自噬，誘發(fā)心肌細胞損傷。

Res的抗MIRI作用可能與調(diào)控細胞自噬有關。研究證實，Res可通過升高LC3Ⅱ蛋白表達、ATP含量和自噬小泡，以及抑制西羅莫司（雷帕霉素）和p70S6激酶，激活心肌細胞自噬，抑制心梗面積擴大，改善心功能，減輕小鼠MIRI［18］。研究發(fā)現(xiàn)，Res后處理能通過增加自噬體形成、提高LC3Ⅱ和Beclin 1的水平降低H/R誘導的H9c2心肌細胞損傷［19］。本研究結(jié)果顯示，Res預處理可激活H/R損傷的心肌細胞內(nèi)Beclin 1蛋白，LC3Ⅱ和P62表達水平明顯上調(diào)，LC3陽性細胞率增加，提示Res可活化自噬；而加用CQ后LC3Ⅱ和P62的表達水平和LC3陽性細胞率均進一步增加，提示可逆轉(zhuǎn)Res的心肌保護作用。以上結(jié)果提示，Res對H/R損傷的心肌細胞的保護作用機制可能是通過活化自噬發(fā)揮的。

綜上所述，本研究采用乳大鼠心肌細胞H/R損傷模擬MIRI模型，發(fā)現(xiàn)Res可通過活化自噬以降低H/R誘導的心肌細胞LDH漏出率和凋亡率，減輕心肌細胞損傷，表明Res對H/R造成的心肌細胞損傷具有改善作用，為Res在MIRI的潛在臨床應用提供實驗依據(jù)。