周化騰 胡文躍 杜偉斌 胡華輝 蔡兵兵 王利祥

負(fù)壓封閉引流（vacuum-assisted closure，VAC）是一種利用負(fù)壓吸引裝置在創(chuàng)面處形成負(fù)壓，持續(xù)引流吸除滲液，促進(jìn)創(chuàng)面愈合的治療技術(shù)[1]。VAC已經(jīng)廣泛應(yīng)用于深度燒傷、糖尿病足潰瘍、開放性骨折等所致的四肢皮膚軟組織缺損，甚至肌腱裸露創(chuàng)面[2-4]。盡管如此，VAC技術(shù)用于血管裸露創(chuàng)面仍具有極大風(fēng)險(xiǎn)。對于此類創(chuàng)面，如何在使用VAC徹底引流的同時確保裸露血管通暢和完整，對于擴(kuò)大VAC技術(shù)的適應(yīng)證，豐富臨床治療手段具有重要意義。目前國內(nèi)外關(guān)于VAC技術(shù)治療血管裸露創(chuàng)面的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)以自制血管保護(hù)套聯(lián)合VAC技術(shù)治療兔下肢血管裸露創(chuàng)面，觀察治療后兔下肢血管通暢率、創(chuàng)面愈合率及愈合質(zhì)量，探討該方法的安全性及有效性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及儀器 清潔級新西蘭家兔24只，體重3.0～3.5 kg，不分雌雄，由杭州余杭科聯(lián)兔業(yè)有限公司提供[動物合格證號：SYXK（浙）2017-0004]。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25℃，相對濕度50%～70%。負(fù)壓吸引裝置購自韓國大熊制藥有限公司，生理采集系統(tǒng)（BL-420S）購自成都泰盟軟件有限公司。自制血管保護(hù)套材質(zhì)為醫(yī)用硅膠，外徑6 mm，內(nèi)徑4 mm。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心倫理委員會審查通過。

1.2 動物分組與造模 24只新西蘭家兔采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、VAC組、聯(lián)合治療組，每組8只。禁食6 h后，家兔以3%戊巴比妥行耳緣靜脈注射麻醉，右大腿內(nèi)側(cè)區(qū)域備皮、消毒，仰臥位固定。右大腿內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)3 cm×4 cm創(chuàng)面，切除皮膚及部分淺筋膜，游離并充分暴露股動脈，創(chuàng)面徹底止血。術(shù)后家兔繼續(xù)單籠飼養(yǎng)，術(shù)后3 d每天肌肉注射青霉素80萬U。

1.3 創(chuàng)面處理 造模成功后，模型組家兔創(chuàng)面予0.9%氯化鈉溶液紗布濕敷，術(shù)后當(dāng)天開始換藥治療，以0.9%氯化鈉溶液清洗創(chuàng)面，聚維酮碘消毒后，無菌紗布敷料覆蓋，并以生物膜覆蓋固定敷料。VAC組創(chuàng)面以相應(yīng)大小的VAC敷料覆蓋，敷料周邊與創(chuàng)緣縫合固定，95%乙醇溶液擦拭創(chuàng)緣皮膚后，以生物膜完全密封創(chuàng)面；安裝吸引盤并聯(lián)通負(fù)壓吸裝置，調(diào)整負(fù)壓為-120 mmHg，維持負(fù)壓吸引。聯(lián)合治療組先以長度為2 cm的血管保護(hù)套覆蓋裸露的股動脈，再按前述方法安裝負(fù)壓吸引裝置，同樣維持-120 mmHg負(fù)壓吸引。若發(fā)現(xiàn)貼膜漏氣或引流管堵塞，則及時更換貼膜或VAC敷料。分別于治療后第7、14天行創(chuàng)面換藥、拍照。

1.4 評價(jià)方法

1.4.1 大體觀察 觀察創(chuàng)面水腫、滲出、肉芽生長情況以及裸露血管形態(tài)。

1.4.2 創(chuàng)面愈合率測定 分別于治療后第7、14天用無延展性透明膜覆蓋于創(chuàng)面上，描繪各組創(chuàng)面輪廓并掃描錄入計(jì)算機(jī)，以MIG2000軟件計(jì)算各創(chuàng)面面積。愈合率=（治療前創(chuàng)面面積-治療后創(chuàng)面面積）/治療前創(chuàng)面面積×100%。

1.4.3 創(chuàng)面裸露血管鏡下觀察 治療后第14天，切取創(chuàng)面中裸露的股動脈節(jié)段，光學(xué)顯微鏡下觀察血管形態(tài)、管壁厚度、管腔通暢及血栓情況。

1.4.4 創(chuàng)面組織新生血管相關(guān)基因表達(dá)水平檢測 采用RT-qPCR法檢測創(chuàng)面組織。切取創(chuàng)面組織及創(chuàng)緣2 mm正常皮膚，按照Trizol試劑盒（大連寶生物工程有限公司）說明從組織標(biāo)本提取RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測提取到的RNA濃度。使用RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒（美國Thermo Scientific公司）合成cDNA。采用 SYBRRGreen Realtime PCR Master Mix（日本TOYOBO公司）試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，由杭州赫貝科技有限公司完成。每個反應(yīng)使用0.5 μl cDNA樣品。所有反應(yīng)均在ABI 7500 Fast儀器上進(jìn)行，并通過ABI Relative Quantification Study software（美國 Applied Biosystems公司）進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)設(shè)立陽性對照組，并用雙蒸水作為cDNA的陰性對照。以管家基因β-actin作為內(nèi)參，并經(jīng)過至少3次獨(dú)立分析驗(yàn)證?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量采用2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算，所使用的引物見表 1。

表1 新生血管相關(guān)基因PCR擴(kuò)增用引物

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prism 7.04統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 24只家兔飼養(yǎng)良好，實(shí)驗(yàn)過程中均未出現(xiàn)死亡。模型組未出現(xiàn)敷料松脫現(xiàn)象；VAC組和聯(lián)合治療組各有1只在術(shù)后3 d內(nèi)出現(xiàn)VAC引流管堵塞，均及時發(fā)現(xiàn)并重新更換VAC敷料或貼膜。

2.2 創(chuàng)面大體觀察 治療后第7天聯(lián)合治療組和VAC組家兔創(chuàng)面水腫、滲出以及肉芽生長情況均好于模型組，聯(lián)合治療組家兔創(chuàng)面血管受壓情況好于VAC組和模型組。治療后第14天聯(lián)合治療組家兔創(chuàng)面肉芽生長情況及血管受壓情況好于VAC組和模型組。3組家兔治療后第7、14天創(chuàng)面情況見表2。

2.3 創(chuàng)面愈合率比較 治療后第7、14天聯(lián)合治療組家兔創(chuàng)面愈合率均高于VAC組和模型組，VAC組家兔創(chuàng)面愈合率均高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。治療后第14天3組家兔創(chuàng)面愈合率均高于治療后第7天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

2.4 創(chuàng)面裸露血管鏡下所見 鏡下見VAC組家兔血管扁平，管壁增厚，管腔部分或完全阻塞，內(nèi)見血栓伴機(jī)化；而聯(lián)合治療組家兔血管形態(tài)無異常，管壁無明顯增厚，管腔通暢，無明顯血栓（圖1）。

2.5 新生血管相關(guān)基因表達(dá)水平比較 3組家兔治療后第7、14天新生血管相關(guān)基因表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。治療后第7、14天聯(lián)合治療組新生血管相關(guān)基因表達(dá)水平均高于VAC組和模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

3 討論

血管裸露是臨床上VAC應(yīng)用的高風(fēng)險(xiǎn)因素[5]。理論上，VAC的負(fù)壓將形成對裸露血管的壓迫，從而導(dǎo)致血管變形，進(jìn)而閉塞。本實(shí)驗(yàn)通過動物造模，形成裸露血管創(chuàng)面，評估VAC對裸露血管的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示治療后第14天，VAC組創(chuàng)面裸露血管部分或完全阻塞，證實(shí)了VAC對血管的壓迫。為了解決VAC對裸露血管的影響，筆者選用具有良好生物相容性的醫(yī)用硅膠自制血管保護(hù)套，并在實(shí)驗(yàn)中調(diào)整材料參數(shù)，確保該血管保護(hù)套既能夠容納血管，又能形成一定的支撐，以使血管免于直接壓迫。本實(shí)驗(yàn)顯示使用了血管保護(hù)套的聯(lián)合治療組家兔創(chuàng)面裸露血管鏡下通暢情況優(yōu)于VAC組和模型組，說明了血管保護(hù)套的有效性。血管保護(hù)套的應(yīng)用，將使血管裸露不再成為VAC應(yīng)用的禁忌。

表2 3組家兔治療后第7、14天創(chuàng)面大體觀察比較

表3 3組家兔治療后第7、14天創(chuàng)面愈合率比較

圖1 創(chuàng)面裸露血管鏡下所見[a：負(fù)壓封閉引流（VAC）組；b：聯(lián)合治療組；×10]

表4 3組家兔治療后第7、14天新生血管相關(guān)基因表達(dá)水平比較

此外筆者還進(jìn)一步評估了血管保護(hù)對局部創(chuàng)面愈合的影響。本實(shí)驗(yàn)選取與新生血管密切相關(guān)的4個基因，用來評估保護(hù)血管對創(chuàng)面血供的影響。CD31存在于血小板、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和某些類型的T細(xì)胞表面，參與血管生成和整合素的激活。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用[6]。PDGF是貯存于血小板α顆粒中的一種堿性蛋白質(zhì)，是低分子量促細(xì)胞分裂素[7]，而ephrin B2是血管發(fā)生的關(guān)鍵基因之一[8]。檢測創(chuàng)面組織中新生血管相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果顯示聯(lián)合治療組上述基因表達(dá)水平均高于VAC組，說明血管保護(hù)套聯(lián)合VAC治療比單純應(yīng)用VAC治療的創(chuàng)面在愈合過程中有更多的新生血管。更多的新生血管意味著更好的血供，血供的改善將進(jìn)一步促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，聯(lián)合應(yīng)用血管保護(hù)套和VAC，比單純VAC治療具有更高的創(chuàng)面愈合率。以上結(jié)果說明對裸露血管的有效保護(hù)，不僅能保證下肢的血供不受影響，更具有潛在的通過改善局部血供促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。

人的股動脈由旋股外側(cè)動脈、肌皮穿支走行至皮膚，為局部皮膚提供血供，在本實(shí)驗(yàn)中，兔股動脈也同樣存在類似的皮支。筆者推測，血管保護(hù)套保護(hù)創(chuàng)面裸露血管，能確保周圍皮膚組織的血供，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。但是，該推測的直接證據(jù)尚不充分，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，本研究對血管組織結(jié)構(gòu)分析不足，有待后續(xù)研究補(bǔ)充相關(guān)數(shù)據(jù)，如血管組織切片等，以更好地評估血管保護(hù)套聯(lián)合VAC治療對血管結(jié)構(gòu)的影響。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過血管保護(hù)套聯(lián)合VAC治療血管裸露創(chuàng)面，證實(shí)VAC對血管的壓迫，以及應(yīng)用血管保護(hù)套可有效避免血管受壓，而對血管的保護(hù)能進(jìn)一步改善創(chuàng)面血供，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本實(shí)驗(yàn)為臨床VAC技術(shù)的正確應(yīng)用提供了有益的參考，同時也為血管裸露創(chuàng)面的治療提供了一種可以選擇方式。