錢潤梅 彭發(fā)全 陳萍

結直腸癌是臨床上較常見的胃腸道惡性腫瘤，發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重威脅人類健康[1]。盡管近年來結直腸癌診斷和治療技術取得很大進展，但病死率仍然很高[2]。因此，尋找新的結直腸癌診斷標志物，開發(fā)新的治療靶點迫在眉睫。近年來研究發(fā)現(xiàn)遺傳改變和表觀遺傳修飾在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，但與結直腸癌有關的研究較少[3]。ARM重復X連鎖蛋白2（ARM proteins lost in epithelial cancers X chromosome 2，ARMCX2）是ARMCX家族重要成員，在細胞惡性轉變過程中發(fā)揮重要作用[4]?；讓由掀ぜ毎蠥RMCX2表達上調，是促進細胞增殖的重要基因[5]。但ARMCX2在結直腸癌中的表達研究較少。本研究通過檢測結直腸癌中ARMCX2的陽性表達，分析其與臨床病理特征的關系以及與K-ras基因突變的相關性，為結直腸癌臨床診斷提供新的標志物。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2012年1月至2014年8月在浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院確診為結直腸癌的患者87例，術后病理檢查結果均為結直腸腺癌。其中男46例，女41 例；年齡 34～88（59.5±11.5）歲，＜60 歲 47 例，≥60歲40例；高分化20例，中分化45例，低分化22例；腫瘤最大徑＜5 cm 42例，≥5 cm 45例；浸潤深度未侵出肌層37例，侵出肌層50例；有淋巴結轉移23例，無淋巴結轉移64例；有血管淋巴管侵犯67例，無血管淋巴管侵犯20例；TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期25例，Ⅲ期40例，Ⅳ期11例。納入標準：（1）依據(jù)WHO中結直腸癌的病理診斷標準[6]，并由病理醫(yī)師復核切片；（2）首次確診并進行手術治療；（3）臨床及病理資料齊全。排除標準：（1）患有 Lynch 綜合征者；（2）術前進行放、化療者；（3）有異源性分化者；（4）有腸道手術史者。并留取距結直腸癌組織邊緣＞3 cm的正常結腸黏膜組織（癌旁組織）87例作為對照。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過，符合《赫爾辛基宣言》中的相關要求，家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 B細胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）（ZM-0010）、Bcl-2 相關 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（SC-7480）和 GAPDH（TA309157）購自北京中杉金橋生物技術公司；qRTPCR試劑盒購自蘇州睿贏生物技術有限公司；引物由蘇州睿贏生物技術有限公司合成；ARMCX2（P-14）濃縮液購自美國Santa Cruz公司；增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（RLM3031） 濃縮液購自蘇州睿贏生物技術有限公司；人K-ras基因7種突變檢測試劑盒（HWTS-113）購自江蘇宏微特斯醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 結直腸癌組織和癌旁組織中ARMCX2表達及結直腸癌組織中PCNA表達檢測 采用免疫組化法。結直腸癌組織和癌旁組織石蠟包埋，切取4 μm厚切片，80%甲醇孵育10 min阻斷內源過氧化物酶活性；PBS清洗，0.1 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復；PBS清洗，滴加 50 μl一抗（ARMCX2稀釋濃度為 1:350，PCNA 稀釋濃度為 1:200）37 ℃孵育1 h。PBS清洗，滴加 50 μl辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育1 h；PBS清洗，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶37℃孵育1 h。PBS清洗，DAB顯色復染后封片，顯微鏡下觀察：ARMCX2表達的部位是細胞質和（或）細胞膜，PCNA表達的部位是細胞核，以棕褐色判斷為陽性。根據(jù)3個高倍鏡視野中陽性細胞所占比例進行評分。

1.4 結直腸癌組織和癌旁組織中Bax和Bcl-2蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。結直腸癌組織和癌旁組織研磨后，12 000 g/min 4℃離心15 min，將上清液轉移到1.5 ml離心管中分裝，測定蛋白濃度。取20 μl蛋白質溶液，加入樣本至孔中，電泳，取出凝膠，并根據(jù)蛋白Marker所指示的位置，將目的蛋白所在的條帶剪下，取出PVDF膜進行免疫雜交，取出膜后加入超敏發(fā)光液，發(fā)光時間2 min。將膜取出放入X線膠片盒曝光3 min，顯影20 s。將各條帶用Image J軟件進行灰度掃描并以GAPDH為內參校正。

1.5 結直腸癌組織中K-ras基因突變檢測 參考潘理會等[7]方法，大致過程如下：使用組織DNA提取試劑盒從之前制作好的腫瘤組織標本中提取所需DNA樣本。瓊脂糖凝膠鑒定提取出的DNA純度。K-ras基因突變檢測試劑盒對所提取的 DNA標本進行 K-ras基因第二外顯子第12、13密碼子基因突變分析。反應體系：95℃8 min，循環(huán) 1 次；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)15次；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，循環(huán) 31次。K-ras基因發(fā)生突變主要是1號外顯子中第12、13號密碼組發(fā)生變異。K-ras上游引物：5′-AAATCTGGGCAGGCTG-3′，下游引物：5′-CAACTTACTGGGTACGCTT-3′；G 和 A 簡并引物：5′-TTGTGGTAGTTGGAGCT-3′。在60℃時收集信號，用CXF96軟件分析K-ras基因狀態(tài)。判斷標準：以無模板對照擴增曲線的最高點為準設定閾值。沒出現(xiàn)擴增曲線或Ct值為0的標本為無K-ras突變；出現(xiàn)擴增曲線且Ct≤26.0的標本為K-ras突變；出現(xiàn)擴增曲線且26.0＜Ct≤28.0的標本為K-ras突變假陽性，需再次檢測。

1.6 術后隨訪情況 患者術后隨訪5年，截止至2019年8月15日。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。結直腸癌組織中ARMCX2與PCNA、Bax、Bcl-2的相關性分析采用Pearson相關。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織和癌旁組織中ARMCX2的表達及結直腸癌組織中PCNA的表達 結直腸癌組織中ARMCX2陽性表達率為51.7%（45/87），高于癌旁組織的10.3%（9/87），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=34.800，P＜0.01），見圖1。結直腸癌組織中PCNA陽性表達率為43.7%（38/87），見圖 2。

圖1 結直腸癌組織和癌旁組織中ARM重復X連鎖蛋白2（ARMCX2）的表達（a：ARMCX2在癌旁組織中陰性表達，未見著色；免疫組化，×200；b：ARMCX2在結直腸癌組織中陽性表達，表達部位是細胞質和細胞膜；免疫組化，×400）

圖2 結直腸癌組織中增殖細胞核抗原（PCNA）的表達，陽性細胞表達部位是細胞核（免疫組化，×200）

2.2 結直腸癌組織中ARMCX2陽性表達與臨床病理特征的關系 結直腸癌組織中ARMCX2陽性表達與腫瘤最大徑、浸潤深度、淋巴結轉移、血管淋巴管侵犯和TNM分期均有關（均P＜0.05），而與性別、年齡和分化程度均無關（均P＞0.05），見表1。

表1 結直腸癌組織中ARMCX2陽性表達與臨床病理特征的關系[例（%）]

2.3 結直腸癌組織和癌旁組織中Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較 與癌旁組織相比，結直腸癌組織中Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05），見表 2、圖 3。

2.4 結直腸癌組織中ARMCX2與PCNA、BAX、Bcl-2的相關性分析 Pearson相關分析顯示ARMCX2與BAX 的表達呈負相關（r=0.63，P＜0.01），與 Bcl-2、PCNA的表達均呈正相關（r=0.35和0.70，均P＜0.05），見圖4。

表2 結直腸癌組織和對應癌旁組織中Bax和Bcl-2表達水平比較

圖3 結直腸癌組織和對應癌旁組織中B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bax）蛋白表達的電泳圖（ARMCX2為ARM重復X連鎖蛋白2）

2.5 有無K-ras基因突變的結直腸癌組織中ARMCX2的表達比較 結直腸癌組織中有K-ras基因突變66例，無K-ras基因突變21例。有K-ras基因突變的結直腸癌組織中ARMCX2陽性表達率為85.7%（18/21），高于無K-ras基因突變的40.9%（27/66），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.808，P＜0.01）。

2.6 ARMCX2表達陽性與陰性結直腸癌患者的生存分析 87例結直腸癌患者到隨訪截止時存活24例，死亡60例，失訪3例；術后生存時間為10～60個月，中位生存時間29個月。生存分析顯示ARMCX2的表達與生存時間有關（χ2=5.021，P＜0.05），見圖 5。

3 討論

ARMCX家族通過調控信號轉導、調節(jié)細胞連接和細胞骨架蛋白的形成，對下游的細胞信號傳遞起重要作用[8]。但關于ARMCX2的研究較少，ARMCX2與ARMCX1具有高度同源性。ARMCX1參與了宮頸癌、乳腺癌和口腔鱗癌的增殖和凋亡，與腫瘤的發(fā)生有關[9-10]。筆者推測ARMCX2表達可能也參與腫瘤發(fā)生過程，本研究發(fā)現(xiàn)結直腸癌組織中ARMCX2的表達升高，且與腫瘤最大徑、浸潤深度、淋巴結轉移、血管淋巴管侵犯及TNM分期均有關，同時ARMCX2的表達與結直腸癌患者生存時間有關，提示ARMCX2表達升高是結直腸癌進程的重要因素，其高表達預示著結直腸癌不良預后。

研究報道ARMCX2參與調節(jié)細胞周期激酶的活性，使細胞在G0期的時間縮短[11]。PI3K導致ARMCX2的表達異常，引起下游核因子通路異?；罨?，調控腫瘤細胞的增殖過程[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)結直腸癌組織ARMCX2表達與凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2表達有關，提示ARMCX2高表達是促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡的重要分子因素。

K-ras基因突變存在于約20%的腫瘤中，K-ras通過上調血管內皮生長因子來誘導腫瘤的血管生成[14]。本研究發(fā)現(xiàn)有K-ras基因突變的結直腸癌組織中ARMCX2陽性表達率高于無K-ras基因突變，差異有統(tǒng)計學意義，提示ARMCX2可作為結直腸癌發(fā)展與預后的重要指標。

綜上所述，結直腸癌中ARMCX2表達升高，其高表達在促進腫瘤細胞增殖和抑制凋亡的過程中有重要作用。ARMCX2與K-ras基因突變有關。ARMCX2可能是結直腸癌重要的預后因子。

圖4 結直腸癌組織中ARM重復X連鎖蛋白2（ARMCX2）與B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bax）、增殖細胞核抗原（PCNA）的相關性分析

圖5 ARM重復X連鎖蛋白2（ARMCX2）表達陽性與陰性結直腸癌患者的生存曲線比較