祁敏芳 吳慧娟 鄭貞蒼 徐挺立 林露

缺血性腦卒中臨床上常見，在老年人群中發(fā)病率較高[1]。研究證實梗死組織周邊缺血半暗帶的血流恢復(fù)能減輕患者的臨床癥狀，但引起的缺血再灌注損傷會導(dǎo)致更嚴(yán)重的腦損傷[2]。缺血再灌注損傷過程中的細(xì)胞凋亡是造成腦損傷的重要機(jī)制。絞股藍(lán)總苷（gypenosides，Gyp）是宿根草質(zhì)植物，味甘苦，性涼，結(jié)構(gòu)類似于人參的藥理活性成分人參皂甙[3]。近年來發(fā)現(xiàn)Gyp的藥理作用包括神經(jīng)活性保護(hù)、消除氧自由基、抗缺血再灌注損傷、抗腫瘤、調(diào)節(jié)脂代謝等[4]。研究證實Gyp可減輕小鼠腎臟缺血/再灌注損傷[5]。然而，關(guān)于Gyp對腦缺血/再灌注損傷的作用及機(jī)制鮮有報道。p21活化蛋白激酶（p21-activated kinase，PAK）家族在腦組織中有廣泛表達(dá)，PAK1是其家族成員之一，主要表達(dá)于海馬CA1區(qū)，能夠被多種突觸蛋白所激活。有研究表明PAK1與大頭畸形、癲癇發(fā)作和言語延遲等神經(jīng)發(fā)育障礙疾病相關(guān)[6-7]。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB）是一種具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄功能的核內(nèi)蛋白質(zhì)。有研究表明CREB表達(dá)沉默可促進(jìn)氧糖剝奪/復(fù)氧皮層神經(jīng)元的凋亡[8]。本研究擬建立Gyp缺氧/復(fù)氧（oxygen/reoxygenation，O/R）小鼠海馬HT22細(xì)胞模型來觀察Gyp對PAK1、CREB表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基（批號：D6046）購自美國 Gibco 公司；FBS（批號：KL-NXQ05）、四唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）相關(guān)試劑（批號：KLS0050）均購自上?？道噬锟萍加邢薰?；鼠源βactin抗體（批號：T0022）購自美國Affinity公司；鼠源B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）（批號：10195-MM09）、鼠源 Bcl-2相關(guān) X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）（批號：10195-MM09）抗體均購自北京綠源伯德生物科技有限公司；鼠源PAK1抗體（批號：AMP5062-11）購自上海煊翎生物科技有限公司；鼠源CREB抗體（批號：ab32515）購自上?？泼羯锟萍加邢薰?；羊抗鼠IgG二抗（批號：BIR711）購自北京博爾西科技有限公司；絞股藍(lán)總皂苷標(biāo)品（純度99.9%）由北京大學(xué)安康藥物研究所（中國陜西）提供，絞股藍(lán)總皂苷標(biāo)品溶于80%乙醇溶液，最終儲存濃度為0.1 kg/L；蛋白提取試劑盒（批號：PR-0075）購自上海Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1062）、BCA蛋白檢測試劑盒（批號：P0011）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BD FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；CX23型電子熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；3111型 CO2培養(yǎng)箱、3131型三氣培養(yǎng)箱、Varioskan LUX型多功能微孔板讀數(shù)儀均購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠海馬HT22細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，置于含10%FBS和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃，相對濕度98%，5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%融合度時，換液、胰酶消化傳代，收集對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 O/R模型建立、分組及Gyp藥物處理 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度為2×104個/ml，接種于6孔板中，每孔 200 μl，缺氧 6 h后，復(fù)氧，建立 O/R 模型[2]。參照文獻(xiàn)[8]，將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組、O/R組、70 mg/L Gyp O/R組、85 mg/L Gyp O/R組和100 mg/L Gyp O/R組5組，每組設(shè)置6個復(fù)孔。除正常對照組外其余組將對數(shù)生長期細(xì)胞放入含94%N2+5%CO2+1%O2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，在37℃，相對濕度98%，5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，70 mg/L Gyp O/R組、85 mg/L Gyp O/R組和100 mg/L Gyp O/R組培養(yǎng)基中Gyp的終濃度分別為70、85和100 mg/L。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將各組細(xì)胞接種于含有蓋玻片6孔板內(nèi)，過夜后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照。

1.2.4 小鼠海馬HT22細(xì)胞凋亡率檢測 收集1.2.2中各組細(xì)胞，密度調(diào)整為5×104個/ml，接種于6孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔，在37℃，相對濕度98%，5%CO2下培養(yǎng)，待貼壁細(xì)胞生長至融合度70%～80%左右，按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明對小鼠海馬HT22細(xì)胞進(jìn)行處理，借助流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，采用CellQuest軟件捕獲數(shù)據(jù)，并利用ModFit LT4.0軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 小鼠海馬HT22細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。收集1.2.2中各組細(xì)胞，用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品加入制備好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）樣孔中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，濕法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用BSA配制的5%脫脂奶封閉1 h，按照1:800稀釋比例分別加入鼠抗人Bcl-2、Bax、β-actin抗體和按照1:1 000稀釋比例分別加入兔抗人PAK1、CREB、GAPDH抗體作為一抗，4℃孵育過夜，TBST洗脫3次，按照1:1 500稀釋比例加入羊抗鼠IgG二抗和按照1:3 000稀釋比例加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1 h，TBST洗脫3次，以β-actin/GAPDH為內(nèi)參。計算各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、PAK1、CREB蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠海馬HT22細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 正常對照組細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞膜光滑、完整，胞體折光性強(qiáng)，細(xì)胞突觸明顯，突觸之間相互交織成網(wǎng)狀；O/R組細(xì)胞貼壁不緊，細(xì)胞膜皺縮，胞質(zhì)凝聚，細(xì)胞胞體突觸明顯減少，細(xì)胞間連接大量減少；70 mg/L Gyp O/R組、85 mg/L Gyp O/R組、100 mg/L Gyp O/R組細(xì)胞上述現(xiàn)象依次緩解，見圖1。

2.2 Gyp對小鼠海馬HT22細(xì)胞凋亡率的影響 與正常對照組相比，O/R組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與O/R組相比，70 mg/L Gyp O/R組、85 mg/L Gyp O/R組、100 mg/L Gyp O/R組細(xì)胞凋亡率依次降低（均 P＜0.05），見圖2和表1。

圖1 各組小鼠海馬HT22細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化[a：正常對照組；b：缺氧/復(fù)氧（O/R）組；c：70 mg/L絞股藍(lán)總苷（Gyp）O/R組；d：85 mg/L Gyp O/R 組；e：100 mg/L Gyp O/R 組；×200]

圖2 各組小鼠海馬HT22細(xì)胞凋亡情況[a：正常對照組；b：缺氧/復(fù)氧（O/R）組；c：70 mg/L絞股藍(lán)總苷（Gyp）O/R組；d：85 mg/L Gyp O/R組；e：100 mg/LGyp O/R 組]

表1 Gyp對小鼠海馬HT22細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 Gyp對小鼠海馬HT22細(xì)胞中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組相比，O/R組細(xì)胞Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與O/R組相比，70 mg/L Gyp O/R組、85 mg/L Gyp O/R 組、100 mg/L Gyp O/R組細(xì)胞Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平依次降低（均P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平依次升高（均P＜0.05），見圖3和表2。

圖3 各組小鼠海馬HT22細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）蛋白表達(dá)的電泳圖（a：正常對照組；b：缺氧 /復(fù)氧（O/R）組；c：70 mg/L 絞股藍(lán)總苷（Gyp）O/R 組；d：85 mg/L Gyp O/R 組；e：100 mg/L Gyp O/R 組）

表2 Gyp對小鼠海馬HT22細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

2.4 Gyp對小鼠海馬HT22細(xì)胞中PAK1、CREB蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組相比，O/R組細(xì)胞PAK1、CREB蛋白表達(dá)水平均降低（均P＜0.05）；與O/R組相比，70 mg/L Gyp O/R組、85 mg/L Gyp O/R組、100 mg/L Gyp O/R組細(xì)胞PAK1、CREB蛋白表達(dá)水平依次升高（均P＜0.05），見圖 4 和表 3。

圖4 各組小鼠海馬HT22細(xì)胞中p21活化蛋白激酶1（PAK1）、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白（CREB）蛋白表達(dá)的電泳圖（a：正常對照組；b：缺氧 /復(fù)氧（O/R）組；c：70 mg/L 絞股藍(lán)總苷（Gyp）O/R 組；d：85 mg/L Gyp O/R 組；e：100 mg/L Gyp O/R 組）

表3 Gyp對小鼠海馬HT22細(xì)胞中PAK1、CREB蛋白表達(dá)的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)Gyp能減輕O/R小鼠海馬HT22細(xì)胞的細(xì)胞膜皺縮、胞質(zhì)凝聚、細(xì)胞胞體突觸減少、細(xì)胞間連接大量減少的癥狀，提示小鼠海馬HT22細(xì)胞O/R模型造模成功。本研究發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，O/R組細(xì)胞凋亡率較高；與O/R組相比，隨著Gyp濃度增加（70 mg/L、85 mg/L、100 mg/L），細(xì)胞凋亡率逐漸降低，呈濃度依賴性。目前研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞死亡密切相關(guān)，且細(xì)胞凋亡主要存在于缺血半暗帶并對梗死面積具有決定作用[9-10]。腦缺血發(fā)生后，梗死組織周邊缺血，血流減少，同時伴隨著神經(jīng)細(xì)胞不可逆的壞死，腦缺血再灌注后氧供應(yīng)充分可產(chǎn)生大量自由基，加重腦水腫，損傷細(xì)胞核內(nèi)DNA，導(dǎo)致DNA降解[11-12]。羅燦蘭等[13]研究發(fā)現(xiàn)Gyp可改善腦缺血缺氧引起的血管性癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，推測Gyp具有消除氧自由基，增加腦組織血流量的作用。上述結(jié)果與本研究結(jié)果一致，提示Gyp可能通過改善腦缺血缺氧，增加腦組織血流量來抑制細(xì)胞凋亡。

本研究中O/R組小鼠海馬HT22細(xì)胞Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平較正常對照組高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平則呈相反趨勢；而與O/R組相比，隨著Gyp濃度增加，小鼠海馬HT22細(xì)胞Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平則升高，且呈濃度依賴性，提示Gyp可能通過作用于Bax抑制細(xì)胞凋亡。其中Bcl-2和Bax屬于Bcl-2蛋白家族，是線粒體凋亡的主要成員，Bax/Bcl-2比值升高，能體現(xiàn)細(xì)胞過度凋亡[14]。在腦缺血再灌注中，Bax移位到線粒體表面并增強(qiáng)線粒體膜的通透性，促使細(xì)胞凋亡；Bcl-2則穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制細(xì)胞凋亡[15-17]。

Feng等[18]報道缺氧可導(dǎo)致PAK1乙酰化，從而促進(jìn)腦腫瘤的發(fā)生。有研究表明PAK1表達(dá)沉默后小鼠顯示出嚴(yán)重的腦部發(fā)育受損[19-20]。Bu等[21]研究表明PAK1抑制劑可抑制缺血性中風(fēng)小鼠大腦CREB的活化。CREB是一種具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄功能的核內(nèi)蛋白質(zhì)，有研究表明，其與腦缺血再灌注損傷、癲癇、記憶功能障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[22]。官俏兵等[23]報道發(fā)現(xiàn)丁苯酞可改善腦缺血再灌注損傷中由于CREB表達(dá)及其磷酸化水平均顯著降低而導(dǎo)致的認(rèn)知障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，O/R組小鼠海馬HT22細(xì)胞PAK1、CREB蛋白表達(dá)水平均降低；與O/R組相比，70 mg/L Gyp O/R組、85 mg/L Gyp O/R組、100 mg/L Gyp O/R組細(xì)胞PAK1、CREB蛋白表達(dá)水平明顯升高，且呈濃度依賴性，本研究結(jié)果與上述結(jié)果基本一致，提示Gyp可能通過上調(diào)PAK1、CREB蛋白表達(dá)水平抑制小鼠海馬HT22細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Gyp可能通過激活PAK1、CREB表達(dá)，抑制小鼠海馬HT22細(xì)胞凋亡，但Gyp對兩者的調(diào)控是否涉及到某種信號通路還有待進(jìn)一步研究。