梁 琰,趙志國,張敏敏,劉 倩,耿巖玲,王 曉,趙恒強(qiáng)*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省分析測試中心山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250014;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安 271018;3.山東迪沙藥業(yè),山東威海 264209)

靈芝多糖(Ganodermalucidumpolysaccharides)是靈芝菌絲的次生代謝產(chǎn)物,是靈芝的主要功效成分,具有降血脂、降血糖、抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗腫瘤、提高免疫力等作用[1-3]。多糖是由單糖通過糖苷鍵結(jié)合而成,準(zhǔn)確測定多糖的單糖組成以及各單糖的含量,對于多糖的質(zhì)量控制具有重要意義[4-5]。

水解是測定多糖組成的關(guān)鍵步驟,不同糖苷鍵對水解的敏感性不同,解聚單糖的難易程度也不同,多糖的水解效率將會直接影響其單糖組成測定的準(zhǔn)確性。近年來,研究者們對多糖的降解方法進(jìn)行了大量研究,主要包括酸水解、堿水解、酶解以及電磁輻射等[6]。其中,酸水解法反應(yīng)速率快,水解產(chǎn)物發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的機(jī)率較小,所以在多糖的單糖組成分析中應(yīng)用較廣[7]。但同時也發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)的高溫酸水解方式用于多糖的水解,時間長、能耗大、效率較低[8-9]。超聲提取技術(shù)是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和機(jī)械振動加速藥物有效成分進(jìn)入溶劑,促進(jìn)提取的進(jìn)行,增加有效成分的溶出率,提高藥材的利用率,節(jié)約能源并且避免了高溫對提取成分的影響,具有省時、節(jié)能、提取率高等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于天然產(chǎn)物中有效成分的提取[10-12],但在多糖水解方面的應(yīng)用鮮有報道。

關(guān)于單糖組成及含量的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、離子色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)等[13]。因糖類物質(zhì)沒有紫外吸收,HPLC檢測糖時,需將樣品水解后進(jìn)行衍生化處理,此過程比較繁瑣,且PMP修飾的單糖不穩(wěn)定,特別是在低濃度時,易使最終測定的結(jié)果缺乏可靠性[14]。GC法具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),但很難將多種單糖一次性分開,分離度有局限性,且GC出峰的重現(xiàn)性很差,需要添加內(nèi)標(biāo)物來對單糖進(jìn)行含量的定量分析,這無疑增加了操作的繁瑣程度[15]。HPAEC-PAD法則使用高pH、高濃度的非揮發(fā)性鈉鹽,對儀器系統(tǒng)要求較高,并且不能直接與質(zhì)譜聯(lián)用[16]。單糖分析常用的檢測器主要有紫外檢測器(UV)、示差折光率檢測器(RID)、質(zhì)譜(MS)等。采用UV檢測器分析時,需先對其進(jìn)行衍生化操作,步驟較為繁瑣。RID則靈敏度較低,無法進(jìn)行梯度洗脫,受外界溫度等因素影響較大,系統(tǒng)平衡時間長,特別是對復(fù)雜樣品分析效果較差[17]。MS技術(shù)具備高特異性和高靈敏度的優(yōu)勢,可以詳細(xì)解析化合物的結(jié)構(gòu)特征,但儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜,價格昂貴,使用受到一定的限制[18]。因此,發(fā)展簡單、快速、靈敏的單糖組成分析方法,具有重要意義。

超高效液相色譜技術(shù)(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC)是近年來推出的一種采用亞2微米填料色譜柱的超高效液相色譜系統(tǒng),具有高分離度、高效率、節(jié)省溶劑等優(yōu)勢[19]。而電噴霧式檢測器(CAD)是近年來在市場上被逐步推廣的一款高靈敏度、通用型檢測器,其檢測信號不依賴于被檢測物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu),對不同結(jié)構(gòu)的化合物有一致的響應(yīng)[20],可以避免復(fù)雜的衍生化過程。另外,與蒸發(fā)光散射檢測器(Evaporative Light Scattering Detector,ELSD)和RID相比靈敏度較高,可以耐受梯度洗脫溶劑。目前,該技術(shù)已逐漸用于糖類、脂質(zhì)類、固醇類和皂苷類等樣品的檢測[21-23]。

本研究建立了超聲輔助酸解(UAH)-UPLC-CAD法測定靈芝多糖單糖組成的方法,并對6批赤芝多糖的單糖組成和含量進(jìn)行測定,以期為藥食兩用真菌多糖的單糖組成研究提供方法和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對照品:D-阿拉伯糖(LOT:AJ0702FA14)、L-鼠李糖(LOT:SJ0715GA13)、D-(+)-葡萄糖(LOT:S08J6G1)、D-半乳糖(LOT:AJ0603LA14)、D-(+)-木糖(LOT:B02M6W1)、L-(+)-巖藻糖(LOT:TM0312QB14)、D-甘露糖(LOT:A16O6L4546) 購于上海源葉生物科技有限公司(純度均大于98%);乙腈 瑞典Oceanpak,色譜純；95%乙醇 山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司,分析純;氫氟酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司,色譜純;甲酸銨、濃鹽酸、三氟乙酸 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,分析純;其余試劑 均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水 娃哈哈純凈水;干燥的赤芝子實(shí)體 購于濟(jì)南市藥王樓,產(chǎn)地來源為安徽,由山東省分析測試中心王曉研究員鑒定為赤芝(Ganodermalucidum)。

色譜柱:Waters Xbridge HILIC(2.1 mm×150 mm,2.5 μm)、Waters ACQUITY UPLC Amide柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)、MERCK ZIC-HILIC(2.1 mm×150 mm,2.5 μm);SBL-10DT型恒溫超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;TG16-WS臺式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;萬分之一電子分析天平 德國Sartourius;賽默飛Ultimate 3000高效液相色譜儀 美國,Thermo Fisher。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的提取 將赤芝置于真空干燥箱中(60 ℃)烘干,切片,粉碎,過40目篩。精密稱取2.0 g干燥的樣品粉末置于三角瓶中,加入30.0 mL去離子水,于超聲提取器中提取30 min(90 ℃熱水),后冷卻15 min,將提取液離心(5000 r/min,10 min),抽濾,用水定容至30.0 mL,采用Sevage法除蛋白,直至無蛋白析出。向其中加入4倍體積的95%乙醇,置于4 ℃冰箱中用于沉淀粗多糖(12 h),離心(5000 r/min,15 min),沉淀依次經(jīng)95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌,后置于水浴鍋中干燥,并用5.0 mL熱水(80 ℃)復(fù)溶,再次離心(5000 r/min,15 min),取上清液,用水定容至5.0 mL,備用[24-25]。

1.2.2 多糖的完全水解 吸取700 μL的多糖溶液于水解管中,加入700 μL的三氟乙酸(4.0 mol·L-1)溶液,密封后置于恒溫超聲波清洗機(jī)(70 ℃,功率270 W)中,酸解1 h。產(chǎn)物用氮?dú)獯蹈刹⒂眉状枷礈?以除去TFA殘留[26]。

1.2.3 對照品溶液的配制

1.2.3.1 單個對照品溶液的配制 分別精密稱取阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、巖藻糖和半乳糖對照品各1.0 mg,各置于1 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度均為1.0 mg·mL-1的單個對照品溶液,備用。

1.2.3.2 混合對照品溶液的配制 分別精密稱取阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、巖藻糖和半乳糖對照品各1.0 mg,置于1 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的混合對照品溶液,備用。

1.2.4 樣品溶液的配制 取吹干的樣品用乙腈-水(v∶v=3∶1)溶液定容至1.0 mL,用0.22 μm微孔濾膜過濾后,作為樣品溶液,備用。

1.2.5 檢測色譜條件 流動相A為0.8%甲酸水溶液,B為乙腈,色譜柱:Waters ACQUITY UPLC Amide柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)。梯度洗脫程序:0～6 min,85% B;6～8 min,85% B～72% B;8～12 min,72% B;12～15 min,72% B～50% B。進(jìn)樣量:10 μL;流速:0.4 mL·min-1;柱溫:25 ℃。CAD檢測參數(shù):霧化器溫度35 ℃,氣體源為N2,壓力61.2 Psi,Filter 5.0 sec。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別采用Excel 2010和Origin 7.5軟件進(jìn)行處理和繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖酸解條件的優(yōu)化

2.1.1 酸種類的影響 鹽酸(HCl)、氫氟酸(HF)和三氟乙酸(TFA)是常用于多糖水解的酸,其中,TFA因其易于除去的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用[27]。從圖1(A)可以看出,當(dāng)采用鹽酸和氫氟酸用于靈芝多糖水解時,均有部分單糖未檢出。而在三氟乙酸的酸解作用下,產(chǎn)物中7種單糖均可被檢出。因此,本實(shí)驗(yàn)選TFA用于靈芝多糖的水解。

2.1.2 酸濃度的影響 如圖1(B)所示,隨著TFA濃度的增加各特征峰的峰面積呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,當(dāng)濃度為4 mol·L-1時,水解程度達(dá)到最大,這可能是由于酸濃度過高時,單糖則易轉(zhuǎn)化成糠醛及其衍生物,而濃度低時,水解程度則較低,大部分以多糖的形式存在。因此,選定TFA的濃度為4 mol·L-1。

圖1 酸種類(A)及濃度(B)對水解程度的影響

2.1.3 超聲功率的影響 如圖2(A)所示,超聲功率在150～270 W范圍內(nèi),多糖水解程度隨著超聲功率的提高而快速增加。當(dāng)功率超過270 W后,水解程度則呈現(xiàn)降低趨勢?？紤]到本研究采用的超聲系統(tǒng)具有控溫功能,功率優(yōu)化過程中系統(tǒng)溫度嚴(yán)格控制在60 ℃。結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)[28-29],初步推測可能是因?yàn)檩^高的超聲功率會產(chǎn)生較強(qiáng)的空化和剪切效應(yīng),使得單糖發(fā)生轉(zhuǎn)化或分解,降低了單糖的含量。所以,最終選擇多糖的超聲功率為270 W。

圖2 超聲功率(A)、溫度(B)和時間(C)對水解程度的影響

2.1.4 水解溫度的影響 如圖2(B)所示,水解程度隨著溫度的變化而發(fā)生明顯改變,在30 ℃和50 ℃時,溫度過低,水解程度偏低;當(dāng)溫度升高到70 ℃時,水解程度大幅度提高,各特征峰的峰面積均出現(xiàn)明顯增加;當(dāng)溫度繼續(xù)升高時,部分單糖發(fā)生轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致峰面積降低。因此,選擇70 ℃作為靈芝多糖的水解溫度。

2.1.5 水解時間的影響 如圖2(C)所示,水解時間為0.5 h時,多糖水解不夠充分,產(chǎn)物大部分以多糖形式存在,單糖含量較低;當(dāng)水解時間增加到1 h時,寡糖和多糖開始水解,單糖含量明顯增加;但當(dāng)水解時間繼續(xù)增加時,單糖含量整體則沒有明顯變化。因此,選擇靈芝多糖的水解時間為1 h。

2.2 色譜條件優(yōu)化

為了獲得最佳的色譜分離效果和較短的分離時間,對色譜柱類型、流動相組成、柱溫等色譜條件進(jìn)行了考察。

表1 線性關(guān)系考察

在相同的流動相和梯度條件下,考察了Waters XBridge HILIC(2.1 mm×150 mm,2.5 μm)、Waters ACQUITY UPLC Amide柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)、MERCK ZIC-HILIC(2.1 mm×150 mm,2.5 μm)三種色譜柱,最終選擇Waters ACQUITY UPLC Amide柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)柱作為多糖單糖組成的分析柱。根據(jù)7種單糖的保留時間和分離效果,確定乙腈-水(0.8%甲酸)的溶劑體系。糖類為多羥基物質(zhì),升高色譜柱溫度可以明顯改善單糖的峰型,但溫度過高又會使得糖類物質(zhì)發(fā)生改性[30],因此選擇柱溫為25 ℃。在優(yōu)化的色譜條件下,將每種單糖標(biāo)準(zhǔn)品單個進(jìn)樣分析,和樣品圖進(jìn)行比對,根據(jù)各單糖對照品和樣品的保留時間對各色譜峰進(jìn)行定性分析。混合對照品及樣品的UPLC-CAD色譜圖見圖3。

圖3 混合對照品(A)和樣品(B)的UPLC-CAD色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍考察 分別吸取“1.2.3.1”中配好的7種標(biāo)準(zhǔn)品溶液(葡萄糖、巖藻糖、鼠李糖、甘露糖和半乳糖各10.0 μL,阿拉伯糖20.0 μL,木糖30.0 μL)至容量瓶中,充分混勻后稀釋至不同濃度,按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以各對照品質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)(X),以峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表1。由表1可知,7個單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.999,說明其線性關(guān)系良好。各單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均在兩個數(shù)量級之間,線性范圍較寬。檢出限在0.01～0.17 μg·mL-1之間,說明方法的靈敏度均較高。

2.3.2 儀器精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液,按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測得7個單糖峰的保留時間RSD分別為0.58%(0.27%)(根據(jù)峰1,2的保留時間分別計算,下同)、0.55%(0.55%)、0.80%(0.51%)、0.74%、0.30%、0.62%(0.85%)、0.48%(0.21%),均小于1%;峰面積RSD分別為2.93%(1.31%)(根據(jù)峰1,2的峰面積分別計算,下同)、2.62%(1.02%)、1.96%(0.59%)、4.28%、1.29%、2.99%(2.30%)、1.15%(2.21%),均小于5%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.3 日間精密度試驗(yàn) 每日取同一批次粗多糖樣品按“1.2.4”項(xiàng)下方法制成供試品溶液,按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣2次,連續(xù)測定3 d,測得7個單糖峰的保留時間RSD分別為0.85%(0.35%)(根據(jù)峰1,2的保留時間分別計算,下同)、0.65%(0.31%)、0.08%(0.32%)、0.13%、0.35%、0.46%(0.54%)、0.47%(0.17%),均小于1%;峰面積RSD分別為1.00%(0.08%)(根據(jù)峰1,2的峰面積分別計算,下同)、1.05%(0.82%)、0.97%(0.69%)、0.35%、0.94%、1.11%(0.16%)、0.95%(1.64%),均小于5%。結(jié)果表明日間精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次粗多糖樣品,按“1.2.4”項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液,按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,測得7個單糖峰的保留時間RSD分別為0.60%(0.22%)(根據(jù)峰1,2的保留時間分別計算,下同)、0.40%(0.50%)、0.23%(0.16%)、0.15%、0.39%、0.25%(0.46%)、0.23%(0.14%),均小于1%;峰面積RSD分別為3.53%(2.90%)(根據(jù)峰1,2的峰面積分別計算,下同)、1.95%(1.56%)、1.18%(2.01%)、3.54%、1.74%、2.43%(1.20%)、1.00%(1.83%),均小于5%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于0、3、6、12、18、24 h按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,測得7個單糖峰的保留時間RSD分別為0.71%(0.24%)(根據(jù)峰1,2的保留時間分別計算,下同)、0.40%(0.69%)、0.62%(0.46%)、0.26%、0.80%、0.31%(0.54%)、0.55%(0.21%),均小于1%;峰面積RSD分別為3.50%(2.63%)(根據(jù)峰1,2的峰面積分別計算,下同)、2.68%(2.05%)、2.08%(2.15%)、3.92%、3.48%、1.98%(4.10%)、1.99%(1.81%),均小于5%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批次粗多糖樣品6份,分別精密加入不同量的鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖對照品適量,使得樣品中所含各單糖量與加入的單糖對照品量之比約為1∶1,按“1.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行水解,并按“1.2.4”項(xiàng)下方法制成供試品溶液后按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析檢測,計算加樣回收率,結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

續(xù)表

2.4 樣品測定

多糖是由10個以上的單糖基和糖苷鍵連接而成的天然生物大分子,其單糖組成分析是基礎(chǔ)性和關(guān)鍵性的環(huán)節(jié),水解后的單糖組成復(fù)雜且含量差異較大。采用本實(shí)驗(yàn)方法對提取的靈芝粗多糖樣品經(jīng)“1.2.2”項(xiàng)下方法水解后,按“1.2.4”項(xiàng)下方法制成供試品溶液,根據(jù)“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件分別測定6批次樣品中7種單糖成分的含量。含量測定結(jié)果見表3。

表3 粗多糖水解后單糖含量測定結(jié)果(mg/g)

其水解后的產(chǎn)物由7種單糖共同組成,其含量分別為:鼠李糖(2.42±0.10) mg/g、巖藻糖(2.19±0.08) mg/g、木糖(27.25±0.67) mg/g、阿拉伯糖(11.99±0.29) mg/g、甘露糖(0.45±0.01) mg/g、葡萄糖(0.85±0.04) mg/g和半乳糖(2.36±0.05) mg/g,含量大小依次為:木糖>阿拉伯糖>鼠李糖>半乳糖>巖藻糖>葡萄糖>甘露糖。摩爾比為:鼠李糖∶巖藻糖∶木糖∶阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=5.90∶5.34∶72.64∶31.96∶1.00∶1.89∶5.24。

3 結(jié)論

本研究建立的超聲輔助酸解方法,具有速度快、效率高等顯著優(yōu)勢,結(jié)合UPLC-CAD法可以實(shí)現(xiàn)靈芝多糖單糖組成的快速分析測定。對靈芝多糖酸解產(chǎn)物的單糖組成及含量進(jìn)行分析比較,結(jié)果表明:靈芝多糖的完全水解產(chǎn)物中木糖的含量最高,其次為阿拉伯糖,而鼠李糖、半乳糖、巖藻糖含量接近,葡萄糖和甘露糖的含量較低,研究結(jié)果為評價靈芝藥材質(zhì)量及指導(dǎo)進(jìn)一步開發(fā)利用提供了數(shù)據(jù)支持和技術(shù)參考。