夏俊芳,鄭素慧,翟少華,張志東,蘇金花,艾賽提,武 運(yùn)

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,新疆烏魯木齊 830091;3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;4.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所,新疆烏魯木齊 830091)

葡萄灰霉病是危害葡萄果實(shí)的重要病害之一[1],其病原菌是灰葡萄孢(Botrytiscinerea,簡(jiǎn)稱(chēng)B.cinerea),無(wú)論葡萄處于生長(zhǎng)期、開(kāi)花期還是結(jié)果期,均可被該B.cinerea侵染和破壞,B.cinerea是一種壞死性病原體,能夠在感染期間分泌多種胞外酶和代謝產(chǎn)物殺死宿主細(xì)胞[2],該病原菌也能耐受低溫,保持較高的萌發(fā)率[3],即使在-0.5 ℃條件下,也可以迅速傳播并擴(kuò)散至整串葡萄漿果,導(dǎo)致整個(gè)漿果的最終腐敗,在多個(gè)主要葡萄栽培種植地區(qū),灰霉病的危害非常嚴(yán)重[4-5],嚴(yán)重影響著葡萄與葡萄酒的生產(chǎn)[6-7]。目前對(duì)葡萄灰霉病的防治主要以化學(xué)防治為主,但長(zhǎng)期大量使用化學(xué)殺菌劑,使得病原菌抗藥性增強(qiáng)并產(chǎn)生環(huán)境污染及農(nóng)藥殘留等問(wèn)題[8-9]。葡萄酒是葡萄的發(fā)酵產(chǎn)品,葡萄酒的質(zhì)量主要取決于原料的質(zhì)量,而殘留在葡萄中的農(nóng)藥會(huì)隨著發(fā)酵過(guò)程遷移至葡萄酒中[10]。

消費(fèi)者對(duì)食品中的農(nóng)藥殘留和環(huán)境安全日益關(guān)注,對(duì)開(kāi)發(fā)病害控制的替代方法的需求也在不斷增加[11-12],生物防治是化學(xué)殺菌劑的一種潛在替代方法,目前已篩選出數(shù)種對(duì)葡萄B.cinerea具有拮抗作用的微生物,哈茨木霉(Trichodermaharzianum)[13-14]、綠色木霉(Trichodermaviride)[14]、長(zhǎng)枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)[14]、康氏木霉(Trichodermakoningii)[14]、假絲酵母(Candidaguilliermondii)A42[15]、假絲酵母(Candidasake)CPA-1[16]、假絲酵母(Candidadiversa)SW-W8[17]、畢赤酵母(Pichiapastoris)G5[18]、假單胞桿菌(Pseudomonas)BHG[19]、假單胞桿菌(Pseudomonas)BTZ[19]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BS2[20]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KS1[21]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Em7[22]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)QST713[23]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B12[24]、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloquefaciens)D747[23]、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloquefaciens)B15[25]、洋蔥霍爾德氏菌(Burkholderiacontaminans)B-1[26]等。這些拮抗菌株是生物防治措施中的關(guān)鍵因素,但這些對(duì)葡萄灰霉病具有良好抑菌效果的生防菌株主要篩選于鮮食葡萄內(nèi)生菌或鮮食葡萄園根際微生物,而對(duì)釀酒葡萄及釀酒葡萄園根際微生物的研究較少。

天山北麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)位于北緯43°～45°,屬中溫帶大陸性干旱氣候,土壤為多層結(jié)構(gòu)的沙壤土,特有的氣候、地域特色不僅賦予釀酒葡萄濃郁的香氣和極高的甜度,更有極具開(kāi)發(fā)潛質(zhì)的地域特色微生物資源[27]。本研究將從新疆北麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄根際土壤中分離出具有較強(qiáng)拮抗B.cinerea活性的細(xì)菌菌株,通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特性、16S rDNA基因序列確定拮抗菌的分類(lèi)地位,并評(píng)價(jià)拮抗菌對(duì)B.cinerea的抑菌作用,以期為釀酒葡萄灰霉病的生物防治提供新的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒葡萄根際土樣 新疆天山北麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)部分釀酒葡萄園植株根部大田土樣,采樣后24 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室用于拮抗菌的分離篩選;灰葡萄孢(Botrytiscinerea,B.cinerea) 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基、生化試劑 北京陸橋生物技術(shù)有限公司;酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)液體培養(yǎng)基(葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L) 北京奧博星責(zé)任有限公司;牛津杯(內(nèi)徑6 mm,外徑8 mm,高10 mm) 上海兢翀電子科技發(fā)展有限公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LDZX-40SCI型高壓滅菌鍋 上海早安醫(yī)療器械廠(chǎng)產(chǎn)品;HR40-IIAI生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司;THZ-98AB恒溫培養(yǎng)振蕩箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;LRH-280型生化培養(yǎng)箱 上海森信試驗(yàn)儀器有限公司;HSY2-SP電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng);Quanta FEG250場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電鏡 美國(guó)FEI公司;722可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司;FE20 PLUS pH計(jì) 上海梅特勒托利多儀器有限公司;DJ100-3型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;血球計(jì)數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌的篩選

1.2.1.1B.cinerea培養(yǎng)及孢子懸浮液制備 將保存的B.cinerea進(jìn)行活化,25 ℃下在PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d,用接種針在斜面上刮取適量孢子,放入裝有玻璃珠的250 mL三角瓶中,加入無(wú)菌生理鹽水,振蕩搖勻,用定性濾紙過(guò)濾,去掉菌絲獲得孢子懸浮液,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)將孢子懸浮液的濃度調(diào)整為2.33×109個(gè)/mL,4 ℃保存、待用。

1.2.1.2 拮抗菌的分離純化 采集新疆天山北麓三個(gè)釀酒葡萄園(天山冰湖葡萄酒莊葡萄園、中信國(guó)安瑪納斯葡萄酒廠(chǎng)葡萄園、新疆伊珠葡萄酒廠(chǎng)葡萄園)植株根部大田土樣,每處地方選擇3個(gè)采集點(diǎn),除去根際表層5 cm左右的浮土,取5～10 cm處的土壤,帶回實(shí)驗(yàn)室風(fēng)干、過(guò)篩、混勻,每份土樣稱(chēng)取10 g,溶解于90 mL無(wú)菌水中,加入小玻璃珠在150 r/min的搖床上振蕩30 min,制成6個(gè)(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6)稀釋梯度的土壤懸浮液,均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑取形態(tài)不同的菌落劃線(xiàn)培養(yǎng)至單菌落,純化保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 拮抗菌發(fā)酵液制備 分離純化的形態(tài)不同的細(xì)菌菌落接種于10 mL的BHI液體培養(yǎng)基,37 ℃、120 r/min條件下,培養(yǎng)48 h后,通過(guò)平板稀釋法確定梯度菌懸液結(jié)果分別為3.6×109～3.6×102CFU/mL,于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4 拮抗菌的篩選 采用牛津杯法進(jìn)行抑菌效價(jià),具體操作方法為:將PDA培養(yǎng)基15 mL倒入直徑9 cm的平皿中,將培養(yǎng)基凝固后,吸取200 μL 2.33×109個(gè)/mLB.cinerea懸浮液,均勻地涂布于PDA培養(yǎng)基上,再將牛津杯置于平皿中央,往杯中加入處理后樣品,對(duì)照樣品或無(wú)菌水200 μL,嚴(yán)格按照無(wú)菌操作進(jìn)行。接種后的培養(yǎng)皿置25 ℃培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)5 d,采用十字交叉法測(cè)量牛津杯周?chē)囊志χ睆?每個(gè)處理重復(fù)3次,抑菌效價(jià)最高的拮抗菌分離純化、保存、備用。根據(jù)公式計(jì)算拮抗菌發(fā)酵液的抑菌效價(jià):

抑菌直徑(mm)=抑菌圈直徑(mm)-牛津杯直徑(mm)

抑菌效價(jià)(mm/mL)=抑菌直徑(mm)/發(fā)酵液體積(μL)×1000。

1.2.2 拮抗菌株的鑒定

1.2.2.1 拮抗菌株形態(tài)觀(guān)察 經(jīng)純化的拮抗菌株劃線(xiàn)接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上,于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后,觀(guān)察菌落特征,革蘭氏染色、芽孢染色后光學(xué)顯微鏡觀(guān)察。

1.2.2.2 菌株生理生化鑒定 按照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[28]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[29]對(duì)拮抗菌進(jìn)行相關(guān)生理生化指標(biāo)的測(cè)定。VP測(cè)定、MR測(cè)定、動(dòng)力培養(yǎng)、明膠反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)、西蒙式檸檬酸鹽、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽的利用試驗(yàn)、葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、甘露醇、木糖、乳糖、棉子糖發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解反應(yīng)、酪素、溶菌酶試驗(yàn)。

1.2.2.3 16S rDNA分子生物學(xué)鑒定 利用細(xì)菌16S rDNA,對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,這部分測(cè)序試驗(yàn)由鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司完成。細(xì)菌16S rDNA通用引物27F:5 ′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′;1492R:5′-CGGTTACCTTGTTACG ACTTC-3′,采用單菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積50 μL:預(yù)混液25 μL、正反向引物(10 μmol/L)各1 μL、菌樣模板1 μL、ddH2O 22 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min 30 s,35個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min。擴(kuò)增后,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后將亮度好、純度高的特異性條帶(1500 bp左右)的PCR產(chǎn)物用鼎國(guó)昌盛(NEP025-1)試劑盒切膠回收純化,將對(duì)應(yīng)目的片段置于-20 ℃下保存雙向引物測(cè)序,基因測(cè)序結(jié)果在NCBI通過(guò)BLAST進(jìn)行序列比對(duì)分析,采用MEGA 7.0.14軟件,構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 拮抗菌生長(zhǎng)特性分析

1.2.3.1 拮抗菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)繪制 參考文獻(xiàn)[30],吸取3.6×108CFU/mL的拮抗菌菌液1 mL于100 mL BHI培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速120 r/min,每4 h開(kāi)始用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值,將測(cè)定的光密度值與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖,以不接菌培養(yǎng)液為空白對(duì)照。

1.2.3.2 拮抗菌最適培養(yǎng)溫度測(cè)定 參考文獻(xiàn)[30],吸取3.6×108CFU/mL的拮抗菌菌液1 mL于100 mL BHI培養(yǎng)基中,分別于25、28、30、37、40、45 ℃,120 r/min搖床培養(yǎng)至穩(wěn)定期,用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值,以不接菌培養(yǎng)液為空白對(duì)照。

1.2.3.3 拮抗菌最適pH測(cè)定 參考文獻(xiàn)[30],用1% NaOH或1% HCl,將BHI液體培養(yǎng)基pH分別調(diào)節(jié)為3.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、11.0。吸取3.6×108CFU/mL的拮抗菌菌液1 mL于上述不同pH的100 mL BHI培養(yǎng)基中,37 ℃、120 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期,用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值,以不接菌培養(yǎng)液為空白對(duì)照。

1.2.4B.cinerea拮抗菌抑菌作用初探

1.2.4.1 拮抗菌對(duì)B.cinerea抑菌作用隨時(shí)間變化趨勢(shì) 采用1.2.1.4牛津杯法以PDA平板中接種200 μLB.Cinerea孢子懸液,涂布均勻后,接種100 μL 3.6×108CFU/mL菌懸液于牛津杯中,以無(wú)菌水蒸餾水作對(duì)照,連續(xù)120 h培養(yǎng)觀(guān)察拮抗菌對(duì)B.cinerea的抑菌效果。

1.2.4.2 拮抗菌對(duì)B.cinereaMIC和MBC的測(cè)定 將制備的2.33×109個(gè)/mLB.cinerea孢子懸液吸取0.1 mL,分別加入到10 mL不同濃度的拮抗菌發(fā)酵液中搖勻,于600 nm波長(zhǎng)下用分光光度計(jì)測(cè)定稀釋液初始吸光值,然后在水浴振蕩器中進(jìn)行振蕩培養(yǎng),振蕩頻率50 r/min,于37 ℃培養(yǎng)48 h,取出后再在600 nm分光光度計(jì)下讀數(shù),吸光值與初始吸光值相同的試管濃度為稀釋液的最低抑菌濃度MIC。把測(cè)定完的MIC試管繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)12 h時(shí)間,再在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值,吸光值與初始吸光值仍相同的試管濃度為MBC。

1.2.4.3 不同濃度的拮抗菌株對(duì)B.cinerea抑制作用 采用1.2.1.4法測(cè)定抑菌效果,以PDA平板中接種200 μLB.Cinerea懸液,涂布均勻后備用,分別取100 μL各濃度菌懸液稀釋液(3.6×105～3.6×109CFU/mL)注入牛津杯中,25 ℃培養(yǎng)120 h,觀(guān)察抑菌效果并計(jì)算抑菌效價(jià)。

1.2.4.4 掃描電鏡觀(guān)察拮抗菌株對(duì)B.cinerea菌絲生長(zhǎng)的影響 取1 mL 3.6×108CFU/mL拮抗菌懸液加入到冷卻到45 ℃熔化的25 mL PDA培養(yǎng)基中,混勻后制平板,以不加拮抗測(cè)試液的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。同步接種B.cinerea菌絲塊,25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 h,挑取拮抗菌處理及對(duì)照平板上的邊緣菌絲,將菌絲滴加于粘有碳導(dǎo)電膠帶的樣品臺(tái)上,自然晾干掃描電鏡下觀(guān)察菌絲形態(tài)變化情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1(分析軟件,St Paul,MN)軟件包中Linear Models程序,差異顯著性采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較,應(yīng)用Excel 2016和MEGA 7.0.14制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的篩選結(jié)果

注:同行不同字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。表3、表5同。

從釀酒葡萄根際土壤共分離到15株細(xì)菌,經(jīng)過(guò)挑取形狀、大小、顏色等不同菌落分別劃線(xiàn)接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂,直至無(wú)雜菌落純化培養(yǎng)后分離到T1、T3、M1、M2、Y1 5株菌,拮抗菌牛津杯法篩選結(jié)果如圖1,其中T3出現(xiàn)明顯的抑菌圈,由表1可知,T3菌對(duì)B.cinerea抑菌直徑為31.5±0.2 mm(P<0.05),抑菌效價(jià)為157.5±1.0 mm/mL(P<0.05),其它菌株幾乎對(duì)B.cinerea無(wú)抑菌效果,T3菌株分離于新疆天山冰湖葡萄酒莊釀酒葡萄園。

圖1 拮抗菌株分離信息

2.2 拮抗菌的鑒定結(jié)果

2.2.1 拮抗菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 如圖2,在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,T3菌株菌落圓形、光滑、濕潤(rùn)、乳白色、隆起、邊緣不整齊,菌落直徑大小2 mm;在靜置BHI液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)液出現(xiàn)輕微渾濁,液面呈現(xiàn)褶皺完整的膜,光學(xué)顯微鏡(100×10)觀(guān)察菌體呈細(xì)桿狀,革蘭氏染色為藍(lán)紫色,孔雀綠染色中生橢圓芽孢,T3為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌。

表1 不同細(xì)菌對(duì)灰葡萄孢抑菌效價(jià)

圖2 T3菌形態(tài)學(xué)結(jié)果

2.2.2 拮抗菌生理生化鑒定結(jié)果 菌株T3的生理生化特性情況如表2所示。T3菌株VP反應(yīng)陽(yáng)性,MR反應(yīng)陰性,動(dòng)力培養(yǎng)陽(yáng)性,明膠液化、硝酸鹽還原陽(yáng)性,無(wú)法利用西蒙氏檸檬酸鹽、枸櫞酸鹽,丙二酸鹽利用陽(yáng)性,能發(fā)酵葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、甘露醇、木糖、乳糖,不能發(fā)酵棉子糖,能水解淀粉,分解酪素,溶菌酶反應(yīng)陰性。參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[28]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[29],初步鑒定T3菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

表2 T3菌株生理生化特性

2.2.3 拮抗菌16S rDNA序列分析 通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段為單一條帶,大小長(zhǎng)度約為1500 bp,擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)明顯非特異擴(kuò)增現(xiàn)象,結(jié)果見(jiàn)圖3。菌株16S rDNA序列經(jīng)測(cè)序后經(jīng)NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析,選擇較為相似的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),如圖4,T3菌株與BacillussubtilisstrainASS4B(JQ905096.1)的同源性最高,達(dá)到100%。故T3菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),這與形態(tài)學(xué)、生理生化特征的鑒定結(jié)果一致。

圖3 T3菌株的16S rDNA擴(kuò)增電泳結(jié)果

圖4 T3菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 拮抗菌生長(zhǎng)特性結(jié)果

2.3.1 拮抗菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果 T3的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖5所示,0～4 h屬于延滯期,4～24 h屬于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體快速生長(zhǎng),24 h時(shí)菌體數(shù)量達(dá)到最高值,達(dá)到OD600=0.89,此時(shí)菌體生長(zhǎng)旺盛代謝活性高,24～48 h屬于穩(wěn)定期,此時(shí)期菌體分泌次級(jí)代謝產(chǎn)物,48 h后進(jìn)入衰亡期,體系代謝產(chǎn)物積累,活性逐漸降低,由圖5知T3菌能較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定,發(fā)揮生物活性。

圖5 T3菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.3.2 拮抗菌的最適生長(zhǎng)溫度 T3菌株在不同溫度下的生長(zhǎng)情況如圖6,T3菌株在25～45 ℃內(nèi)均能生長(zhǎng),表明該菌具有較強(qiáng)的耐溫性,當(dāng)溫度為25～37 ℃,隨著溫度的升高,菌株生長(zhǎng)活力逐漸升高,當(dāng)溫度為37～45 ℃,隨著溫度的升高,菌株生長(zhǎng)活力逐漸減小,可見(jiàn)T3菌株最適的生長(zhǎng)溫度為37 ℃。

圖6 不同溫度下T3菌株的生長(zhǎng)情況

2.3.3 拮抗菌的最適pH T3菌株在不同pH下的生長(zhǎng)情況如圖7,在pH3.0～11.0范圍,T3菌株均能生長(zhǎng),pH在3.0～7.0時(shí),菌株生長(zhǎng)能力隨著pH的增大而增大,當(dāng)pH>7.0時(shí)培養(yǎng)液渾濁且形成菌膜,當(dāng)pH>7.0時(shí),菌液OD值逐漸降低,可見(jiàn),T3菌株最適培養(yǎng)pH=7.0。

圖7 不同pH下T3菌株的生長(zhǎng)情況

2.4 拮抗菌對(duì)B. cinerea抑菌作用分析

2.4.1 拮抗菌對(duì)B.cinerea抑菌作用隨時(shí)間變化趨勢(shì) 由圖8和表3知,T3菌株對(duì)B.cinerea抑菌作用隨時(shí)間變化趨勢(shì)圖,培養(yǎng)48 h(圖8B),B.cinerea繞開(kāi)添加T3菌液的牛津杯生長(zhǎng)并出現(xiàn)白色菌絲,此時(shí)期為T(mén)3菌的穩(wěn)定期,抑菌物質(zhì)在此時(shí)期分泌,抑菌直徑為34.5±0.4 mm(P<0.05),抑菌效價(jià)為172.5±2.0 mm/mL(P<0.05);培養(yǎng)72 h(圖8C),B.cinerea孢子顏色變灰黑色,添加T3菌液的牛津杯周?chē)鸁o(wú)B.cinerea生長(zhǎng);培養(yǎng)96 h(圖8D),B.cinerea孢子黑色加深,抑菌現(xiàn)象較明顯,但部分菌絲仍為灰白色;培養(yǎng)120 h(圖8E),B.cinerea孢子黑色,可觀(guān)察到明顯抑菌現(xiàn)象,抑菌直徑為31.4±0.2 mm(P<0.05),抑菌效價(jià)為157.0±1.0 mm/mL(P<0.05)。由圖8、表3知,T3菌對(duì)B.cinerea抑制作用在共培養(yǎng)48 h即可看到抑菌趨勢(shì),即此時(shí)T3菌分泌抑菌物質(zhì),而B(niǎo).cinerea孢子完全成熟需要120 h,可觀(guān)察到明顯抑菌現(xiàn)象,T3菌具有較長(zhǎng)的抑菌物質(zhì)產(chǎn)生期,此抑菌活性物質(zhì)需后期進(jìn)一步分析研究。

圖8 T3菌株抑菌效果隨時(shí)間變化趨勢(shì)

表3 不同培養(yǎng)時(shí)間的T3菌株對(duì)灰葡萄孢抑菌效價(jià)

2.4.2 拮抗菌對(duì)B.cinerea的MIC和MBC 由表4可知,T3菌株對(duì)B.cinerea最小抑菌濃度(MIC)為3.6×105CFU/mL,最小殺菌濃度(MBC)為3.6×106CFU/mL。

表4 T3菌株對(duì)灰葡萄孢的MIC和MBC(CFU/mL)

表5 不同濃度的T3菌懸液對(duì)灰葡萄孢抑菌效價(jià)

2.4.3 不同濃度的拮抗菌對(duì)B.cinerea抑制作用結(jié)果 不同濃度的T3菌對(duì)B.cinerea抑制作用如圖9所示,相對(duì)應(yīng)的抑菌效價(jià)如表5,當(dāng)T3菌濃度為3.6×105CFU/mL,幾乎無(wú)法觀(guān)察抑菌現(xiàn)象(P<0.05),T3菌懸液為3.6×109CFU/mL時(shí)抑菌直徑為31.6±0.2 mm(P<0.05),抑菌效價(jià)達(dá)到158.0±1.0 mm/mL(P<0.05),表明高濃度T3菌懸液對(duì)B.cinerea具有良好的抑制作用,且對(duì)B.cinerea抑菌效價(jià)隨著T3菌懸液濃度的升高而升高。

圖9 不同濃度的T2菌懸液對(duì)灰葡萄孢(Botrytis cinerea)抑制作用

2.4.4 掃描電鏡觀(guān)察T3菌株對(duì)B.cinerea菌絲生長(zhǎng)的影響 圖10A～C對(duì)照組,不同倍數(shù)(×400倍、×800倍、×1600倍)掃描電鏡圖,菌絲稠密粗細(xì)均勻,孢子繁密,原生質(zhì)分布均勻;圖10D～F T3菌處理組,不同倍數(shù)(×400倍、×800倍、×1600倍)掃描電鏡圖,菌絲稀疏粗細(xì)不均勻、菌絲扭曲、畸形,頂端膨大,孢子稀松,原生質(zhì)收縮,出現(xiàn)空洞。T3菌抑制B.cinerea菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)。

圖10 掃描電鏡下T3菌懸液對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

植物根際微生物具有重要的農(nóng)業(yè)意義,芽孢桿菌屬的細(xì)菌具有產(chǎn)孢子能力,能以芽孢形式存活下來(lái),并在有利條件下恢復(fù)活性,這使得芽孢桿菌在開(kāi)放和嚴(yán)酷的環(huán)境中能夠發(fā)揮作用,可開(kāi)發(fā)成環(huán)保和可持續(xù)的生物菌劑[31]。迄今為止,利用芽孢桿菌對(duì)植物病害進(jìn)行生物防治的研究相當(dāng)多,但多數(shù)研究多限于實(shí)驗(yàn)室條件下,生產(chǎn)應(yīng)用較為成功的僅為少數(shù),其中以枯草芽孢桿菌作為生物載體的生物菌劑應(yīng)用最多,如美國(guó)Gustafson公司的Bacillussubtilisstrain GBO3、美國(guó)Agraquest公司Bacillussubtilisstrain QST 713、美國(guó)Becker Underwood公司BacillussubtilisMBI 600、德國(guó)Abitep GmbH公司B.subtilisvar.amyloliquefaciensstrain FZB24等[32]。同時(shí)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)生物菌劑具有降解農(nóng)藥殘留作用,Salunkhe等[33-34]研究發(fā)現(xiàn)葡萄根際分離的枯草芽孢桿菌DR-39、CS-126、TL-171、TS-204在葡萄漿果上顯示出良好的降解農(nóng)藥殘留作用。由此可見(jiàn),枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在植物病害生物防治及降解農(nóng)藥殘留方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

本研究從新疆天山北麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)冰湖葡萄酒莊葡萄園釀酒葡萄植株根際土壤中分離到一株具有明顯拮抗B.cinerea作用的T3菌株,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA測(cè)序鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)確定T3菌為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),培養(yǎng)24～48 h,T3菌株進(jìn)入穩(wěn)定期,T3菌株最適的生長(zhǎng)溫度為37 ℃,最適pH為7.0。T3菌株對(duì)B.cinerea抑制作用在共培養(yǎng)48 h可看到抑菌趨勢(shì),即T3菌48 h分泌抑菌物質(zhì),共培養(yǎng)120 h,可觀(guān)察到明顯抑菌現(xiàn)象,T3菌株具有較長(zhǎng)的抑菌物質(zhì)產(chǎn)生期。T3菌株對(duì)B.cinerea的MIC為3.6×105CFU/mL、MBC為3.6×106CFU/mL,抑菌效價(jià)隨著T3菌懸液濃度的升高而升高,3.6×109CFU/mL T3菌株對(duì)B.cinerea抑菌31.6±0.2 mm(P<0.05),抑菌效價(jià)達(dá)到158.0±1.0 mm/mL(P<0.05),掃描電鏡觀(guān)察T3菌液造成B.cinerea菌絲粗細(xì)不均勻、畸形、扭曲、頂端膨大、原生質(zhì)收縮、孢子稀松,抑制菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)。盡管本研究從新疆天山北麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄地篩選的T3菌具有良好抑制B.cinerea效果,可作為釀酒葡萄灰霉病的潛在生防源,但其抑菌機(jī)理及實(shí)際大田防病效果尚未研究,后續(xù)試驗(yàn)將對(duì)上述問(wèn)題做進(jìn)一步研究,使之成為有效的釀酒葡萄灰霉病生物控制劑。