張薇，閻濤

凝血和免疫是聯(lián)系廣泛、高度整合、微妙平衡的生物系統(tǒng)，防御病原體對(duì)機(jī)體的傷害和入侵，任何成分的失調(diào)都會(huì)影響整個(gè)系統(tǒng)平衡，導(dǎo)致不同程度炎癥和血栓形成，缺血性卒中也是其中之一[1]。2011年Guido Stoll等[2]提出缺血性卒中中“血栓-炎癥”的理念，卒中急性期“血栓-炎癥”級(jí)聯(lián)反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致缺血的進(jìn)展，其病理生理機(jī)制為血液級(jí)聯(lián)系統(tǒng)（補(bǔ)體、接觸、凝血、纖溶系統(tǒng)及血小板）、免疫細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間相互作用[3]。促進(jìn)血栓形成的機(jī)制和反應(yīng)是復(fù)雜多樣的，由于各種放大機(jī)制及不同系統(tǒng)之間的相互作用，任何級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的觸發(fā)都可以迅速導(dǎo)致全面的血栓形成和炎癥的發(fā)生。本文簡要綜述凝血與炎癥之間的分子和細(xì)胞關(guān)系及其在血栓形成中的作用，以期為血栓性疾病的研究策略提供參考。

1 血小板及凝血相關(guān)因子

1.1 血小板 在內(nèi)皮受損后血小板黏附在暴露的血管損傷內(nèi)皮上，暴露的膠原直接與血小板糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅰa/Ⅱa和GPⅥ受體結(jié)合誘導(dǎo)血小板活化，促進(jìn)激活的細(xì)胞釋放介質(zhì)，如ADP、5-羥色胺和凝血酶，進(jìn)一步通過信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活血小板形狀的改變和整合素的表達(dá)，促進(jìn)血小板的粘連[4]。除了止血和血栓形成以外，血小板還參與先天免疫反應(yīng)的病理生理過程，活化的血小板上P-選擇素與內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞表達(dá)的P-選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）結(jié)合，調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞募集和激活，從而介導(dǎo)先天免疫反應(yīng)[5]。此外血小板通過其膜上的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）檢測病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），釋放殺菌產(chǎn)物并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒和中性粒細(xì)胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）的釋放[6]。NET由DNA、組蛋白和其他細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)成分（包括彈性蛋白酶、乳鐵蛋白、髓過氧化物酶和鈣保護(hù)素）形成的中性粒細(xì)胞網(wǎng)狀釋放物組成，可以直接激活內(nèi)源性凝血途徑的凝血因子Ⅻ及組織因子（tissue factor，TF），以啟動(dòng)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)[7]。NET中存在的特異組蛋白H3和H4，不僅表現(xiàn)為損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）激活補(bǔ)體途徑，而且結(jié)合血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）誘捕血小板導(dǎo)致其聚集形成血栓[8]。急性心肌梗死患者的血栓中含有大量中性粒細(xì)胞和高水平的NET，是血栓的重要組成部分，提示NET在動(dòng)脈血栓形成中具有重要作用[9]。同樣，在缺血性卒中患者血栓成分中，發(fā)現(xiàn)活化的中性粒細(xì)胞和瓜氨酸化組蛋白H3[10]。此外，中性粒細(xì)胞來源的絲氨酸蛋白酶和細(xì)胞外核小體也可以誘導(dǎo)血栓形成，通過TF途徑抑制物的局部蛋白水解來加強(qiáng)凝血[11]。因此，血小板作為免疫效應(yīng)細(xì)胞，既能通過TLR識(shí)別病原體，又能與先天免疫細(xì)胞進(jìn)行信號(hào)傳遞以增強(qiáng)其血栓前過程。

血小板活化產(chǎn)生的微粒（micro vesicle，MV）是循環(huán)中MV的主要來源，富含核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和小分子，在血小板與內(nèi)皮細(xì)胞和先天免疫細(xì)胞的聯(lián)系中起著重要的作用[12]。研究表明，攜帶有microRNA的MV可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中不同mRNA的轉(zhuǎn)錄，將巨噬細(xì)胞編程為吞噬表型[13]；來自血小板和其他細(xì)胞的MV可促進(jìn)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，激活TF促進(jìn)血栓形成[14-15]。以上研究結(jié)果表明MV在凝血-炎癥-血栓病理生理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，以MV為工具運(yùn)輸microRNA或納米藥物等策略可能是將來血栓性疾病治療的潛在方向。

1.2 凝血相關(guān)因子 凝血相關(guān)因子是參與凝血過程的生物分子，在凝血過程被相繼激活轉(zhuǎn)為有活性的蛋白酶，TF和凝血酶在凝血過程中發(fā)揮關(guān)鍵靶點(diǎn)作用，當(dāng)血管受損時(shí)，TF與受體凝血因子Ⅶa結(jié)合催化凝血因子X和凝血因子Ⅸ的蛋白水解，導(dǎo)致下游產(chǎn)物凝血酶的生成，進(jìn)而導(dǎo)致纖維蛋白和血栓形成。除了促凝事件外，凝血相關(guān)因子尚能過通特定受體介導(dǎo)血管系統(tǒng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的信號(hào)傳遞發(fā)揮其促炎效應(yīng)。

1.2.1 組織因子 TF是外源性凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要啟動(dòng)因子。MV和單核細(xì)胞是循環(huán)中TF的重要來源[16]，在血小板激活因子（plateletactivating factor，PAF）或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的刺激下，TF移位到細(xì)胞表面，并且血小板的激活可以誘導(dǎo)TF mRNA的成熟、蛋白質(zhì)翻譯和表面易位，觸發(fā)凝血酶生成和血栓形成[17-18]。在心肌梗死動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂后形成的血栓中TF表達(dá)升高，單核/巨噬細(xì)胞及其MV來源的TF活性也升高，表明TF可導(dǎo)致斑塊破裂后的血栓形成[19]。此外，非編碼的microRNA在血管系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)動(dòng)脈粥樣硬化性疾病患者miR-223表達(dá)的治療干預(yù)，可以通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞TF的表達(dá)來減少動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成事件[20]。Ⅶa與其天然受體TF結(jié)合形成TF/Ⅶa復(fù)合物，通過蛋白酶活化受體2（protease-activated receptor-2，PAR-2）途徑激活P44/42絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）、Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）等促炎信號(hào)引起IL-6和其他趨化因子等炎性因子的分泌，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展[21]。因此，TF在動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致血栓形成的起始和發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。

1.2.2 凝血酶 絲氨酸蛋白酶凝血酶是凝血途徑中的關(guān)鍵蛋白，通過促凝促炎效應(yīng)發(fā)揮其止血和血栓作用。凝血酶裂解纖維蛋白原產(chǎn)生纖維蛋白，激活蛋白酶激活受體（proteaseactivated receptor，PAR）的G蛋白偶聯(lián)受體家族介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的直接作用[22]。PAR在血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元等細(xì)胞中表達(dá)。凝血酶切割PAR-1、PAR-3和PAR-4活化血小板，動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)鈣，將黏附分子P-選擇素和CD40配體及與凝血酶原結(jié)合的磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)移到血小板表面[23-24]，釋放凝血因子Ⅴ、纖維蛋白原和凝血因子ⅩⅢ ，進(jìn)一步增強(qiáng)凝血酶的生成和血凝塊的穩(wěn)定性導(dǎo)致血栓形成。

在炎癥方面，凝血酶激活內(nèi)皮細(xì)胞PAR-1，通過核因子-κB（nuclear factor kappalightchain-enhancer of activated B cell，NFκB）介導(dǎo)抑制蛋白I-κB的磷酸化和降解，導(dǎo)致NF-κB易位到細(xì)胞核并刺激各種促炎基因的轉(zhuǎn)錄。這種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)多種促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，包括IL-6、IL-8、轉(zhuǎn)化生長因子-β、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、血小板源性生長因子、細(xì)胞間黏附分子-1和P-選擇素[25-26]。進(jìn)一步介導(dǎo)血小板和白細(xì)胞在內(nèi)皮上的募集、黏附和滾動(dòng)，通過PAR誘導(dǎo)IL-6及成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-8表達(dá)上調(diào)，增大血小板活化效應(yīng)，這些過程形成正反饋回路放大血管表面的炎癥和促凝過程[27]。

2 接觸激活系統(tǒng)

接觸激活系統(tǒng)由4種血漿蛋白組成：凝血因子Ⅺ、凝血因子Ⅻ、前激肽釋放酶（prekallikrein，PK）和高分子量激肽原（high molecular weight kininogen，HK）。接觸蛋白以循環(huán)中的非活性形式接觸帶負(fù)電荷的無機(jī)多聚磷酸鹽（polyphosphate，polyP）發(fā)生激活，分別通過內(nèi)源性凝血途徑和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)啟動(dòng)促凝和促炎反應(yīng)[28]。凝血因子Ⅻ與帶負(fù)電荷的polyP結(jié)合發(fā)生活化，將PK切割成激肽釋放酶（kallikrein，KAL），進(jìn)一步激活凝血因子Ⅺ啟動(dòng)凝血酶和纖維蛋白的形成。血漿激肽釋放酶將HK裂解為BK，與G蛋白偶聯(lián)激肽B2和B1受體結(jié)合啟動(dòng)磷脂酶C、NF-κB等信號(hào)通路導(dǎo)致中性粒細(xì)胞分泌細(xì)胞因子如IL-6、IL-8或TNF-α介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[28-29]；此外BK還可以IL和TNF依賴的方式激活B1受體以響應(yīng)組織損傷和炎癥調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，激活B2受體和TLR導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞的反應(yīng)[30]。除了凝血因子Ⅻ外，PK和HK也都可導(dǎo)致卒中后小鼠微血管血栓形成、血腦屏障滲漏、水腫形成和炎癥。與野生型小鼠相比，PK和HK基因敲除小鼠的腦內(nèi)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞顯著減少，腦梗死體積減小，腦水腫減輕且腦內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤較輕[31-32]。

3 補(bǔ)體系統(tǒng)

補(bǔ)體是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，通過經(jīng)典途徑、凝集素和替代途徑被激活，最終會(huì)聚成中心蛋白酶C3轉(zhuǎn)化酶。C3轉(zhuǎn)化酶進(jìn)一步作用于下游因子產(chǎn)生過敏性毒素C3a和C5a及膜攻擊復(fù)合體C5b-9，在感染的細(xì)胞膜內(nèi)創(chuàng)建跨膜通道，導(dǎo)致細(xì)胞溶解和死亡，構(gòu)成炎癥的重要組成部分。C3a和C5a分別與G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）相結(jié)合而介導(dǎo)多種炎癥和血栓前過程。C3a和C5a誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8、IL-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和T細(xì)胞激活性低分泌因子，促進(jìn)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集和激活，引起內(nèi)皮通透性升高[33]。補(bǔ)體通過C5a介導(dǎo)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的TF表達(dá)、激活的內(nèi)皮細(xì)胞和血小板上P-選擇素的暴露增加及內(nèi)皮細(xì)胞分泌vWF因子介導(dǎo)血栓前過程[34]。補(bǔ)體激活的凝集素途徑的重要組成部分是甘露糖相關(guān)絲氨酸蛋白酶（mannose-binding lectinassociated serine protease，MASP）-1和MASP-2，MASP-1可切割凝血因子ⅩⅢ 、HK、纖維蛋白原和激活凝血酶激活的纖溶抑制物[35]，MASP-2可將凝血酶原切割為凝血酶，裂解C4產(chǎn)生C3轉(zhuǎn)化酶，它們?cè)谘a(bǔ)體激活和凝血中發(fā)揮重要作用[36]。此外，血小板活化后在血凝塊形成過程中形成纖維蛋白，可導(dǎo)致MASP-1和MASP-2的激活[34]，進(jìn)一步放大血栓性疾病中的凝血和炎癥反應(yīng)。

4 纖溶酶原激活系統(tǒng)

纖溶酶原激活系統(tǒng)由一組蛋白酶和蛋白酶抑制劑組成，在血塊溶解的同時(shí)也可以促進(jìn)與血栓形成有關(guān)的炎癥過程，通過降解纖維蛋白和啟動(dòng)促進(jìn)傷口愈合和血管生成的免疫過程來驅(qū)動(dòng)纖溶。在止血或血栓形成過程中凝血酶激活內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和分泌tPA和尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator，uPA）：tPA通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒導(dǎo)致MMP-9、MMP-8、彈性蛋白酶和髓過氧化物酶的釋放[37]，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的遷移；uPA通過中性粒細(xì)胞激活介導(dǎo)激活JNK途徑和NF-κB核轉(zhuǎn)位增加促炎細(xì)胞因子IL-1、人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2和TNF的表達(dá)[38]。此外tPA和uPA水解纖溶酶原產(chǎn)生纖溶酶切割纖維蛋白，增強(qiáng)tPA、纖溶酶原和纖維蛋白之間的相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)纖維蛋白凝塊上的纖溶酶生成，導(dǎo)致纖溶增強(qiáng)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、MMP激活和誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)[39]。纖溶酶還可以直接激活C3和C5[40]，產(chǎn)生炎性過敏毒素C3a、C5a和C5b，啟動(dòng)膜攻擊復(fù)合物免疫反應(yīng)介導(dǎo)炎癥過程。

綜上所述，血小板、TF、凝血酶、接觸激活系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)等在凝血和血栓形成發(fā)展中扮演重要角色，同時(shí)通過多種機(jī)制介導(dǎo)凝血后炎性反應(yīng)，二者相互依存，相互影響。對(duì)炎癥和凝血之間分子機(jī)制的更深入了解，將有助于研究者更有效地識(shí)別血栓性疾病新的治療靶點(diǎn)，同時(shí)調(diào)節(jié)凝血和炎癥的治療策略可能有潛在的價(jià)值。

【點(diǎn)睛】凝血和免疫在血栓的形成中密切相關(guān)，本文綜述了凝血-免疫在血栓形成中的相互作用，為抗栓治療策略的研究提供參考。