1.研究背景

感知并保護生物體免受傷害性刺激的能力依賴于感覺傳入神經(jīng)，這種感覺傳入神經(jīng)被稱為傷害性感受器。通常認為傷害性感受器的神經(jīng)纖維是無髓鞘的，與之相連的Remak 膠質(zhì)細胞起到保護和支持神經(jīng)軸突代謝的作用。這種無髓神經(jīng)的末梢可以被傷害性刺激所激活，因此被稱作皮膚的痛覺感受器。該研究使用表達在神經(jīng)嵴并且是膠質(zhì)細胞特異的Cre 系小鼠與報告基因小鼠交配進行遺傳學標記，研究皮膚膠質(zhì)細胞（施萬細胞）的分布及其與傷害性神經(jīng)末梢之間的相互聯(lián)系。

2. 主要研究方法

研究者主要使用Plp-CreERT2/+; R26REYFP/+(Plp-YFP)、Sox10CreERT2/+; R26RTOM/+(Sox10-TOM) 和Sox2CreERT2/+; R26RTOM/+(Sox2-TOM) 品系的小鼠，采用免疫熒光技術，借助熒光顯微鏡、透射電鏡及免疫電鏡觀察皮膚施萬細胞分布情況及其與傷害性神經(jīng)末梢之間的相互聯(lián)系。

使用Plp-CreERT2/+; R26RChR2/+(Plp-ChR2)、Sox10CreERT2/+; R26R ChR2/+(Sox10-ChR2)、Sox2CreERT2/+; R26R ChR2/+(Sox2-ChR2) 和Sox-10CreERT2/+; R26R ArchT/+(Sox10-ArchT) 品系的小鼠，采用光遺傳技術操控施萬細胞，觀察小鼠疼痛相關行為學變化。從外周組織分離培養(yǎng)末梢施萬細胞，采用細胞外記錄及全細胞膜片鉗技術，檢測傷害性施萬細胞的電學特征。

3. 主要研究結果

在Plp-YFP 和Sox10-TOM 小鼠中，與神經(jīng)標記物PGP9.5 染色的雙標實驗顯示無論是在有毛皮膚還是在無毛皮膚，施萬細胞均處于真皮內(nèi)的相同位置，位于接近真皮/表皮邊界，并與上行性神經(jīng)纖維緊密接觸。此外PlpYFP+、SOX10+和S100b+細胞具有向表皮廣泛伸出的放射狀突起，這一特點與其他的施萬細胞形態(tài)一致。透射電鏡結果顯示從施萬細胞胞體發(fā)出的神經(jīng)末梢位于從真皮/表皮邊界到表皮層的幾微米之外，而且膠質(zhì)細胞是其唯一的胞質(zhì)性鞘膜。神經(jīng)纖維和施萬細胞被一層厚的纖維性膠原所包圍。與其他膠原不同，這些膠原的方向與膠質(zhì)-神經(jīng)復合體的方向一致。這種形態(tài)特異的膠質(zhì)細胞表達豐富的I 型水通道蛋白 (AQR-1)，并與CGRP+、P2RX3+、TRPV1+傷害性感受纖維共標。免疫電鏡觀從超微結構上證實，Sox10-TOM 小鼠的TOMATO 紅色熒光存在于膠質(zhì)細胞中。因此，一種形態(tài)上和分子上特化的施萬細胞（以下稱為傷害性施萬細胞）在皮下邊緣層形成網(wǎng)狀結構，通過與傷害性神經(jīng)纖維的密切聯(lián)系構成膠質(zhì)-神經(jīng)復合體，并通過膠原纖維的結構包繞而相互絕緣。

為了確定傷害性施萬細胞是否介導疼痛的感知，研究者首先分析了Plp-YFP、Sox10-TOM 和Sox2-TOM 小鼠中傷害性施萬細胞在不同膠質(zhì)細胞中的分布。Plp-YFP 和Sox10-TOM 小鼠的熒光表達在傷害性施萬細胞以及梅氏小體、毛囊刺樣結構的終末施萬細胞和神經(jīng)纖維的膠質(zhì)細胞中，但不在默克爾細胞或背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元外面的膠質(zhì)細胞中表達。相比之下，Sox2-TOM 小鼠的熒光不表達在傷害性施萬細胞中，但是表達在其他Sox10-TOM 小鼠表達的膠質(zhì)細胞和默克爾細胞中。因此，將這些小鼠與攜帶光敏感通道的小鼠雜交，所得到的雜交小鼠就可以被用于以下實驗：在不直接刺激感覺神經(jīng)的情況下操控施萬細胞的活動，從而特異性地研究傷害性施萬細胞的功能。

將Plp 和Sox10 小鼠與ChR2-eYFP 小鼠交配獲得Plp-ChR2 和Sox10-ChR2 小鼠，目的是通過光遺傳的方法觀察激活傷害性施萬細胞是否足以引起疼痛樣反應。隨著刺激功率的增加，兩種品系小鼠均有輕度肢體回避行為。手掌部神經(jīng)的細胞外記錄顯示，神經(jīng)放電活動隨著刺激手掌部皮膚的光強增加而增加，所記錄到的放電包括C 纖維的放電，也可能包括高振幅的A 類纖維簇狀放電。低閾值機械感受器 (LTMRs) 末端為毛囊的刺樣結構，可支配默克爾細胞和梅氏小體，引起頭發(fā)彎曲、觸摸、壓力、顫動或振動，但不引起疼痛行為。然而在慢性疼痛中，輕觸激活的神經(jīng)元可導致觸誘發(fā)痛。與表現(xiàn)出刺激強度依賴的縮足反應的Sox10-ChR2小鼠相比，刺激Sox2-ChR2 小鼠LTMR 的施萬細胞不能引起小鼠縮足反應，說明LTMR 的施萬細胞不參與痛行為。光刺激小鼠還引起舔爪、抖動和護足等行為，說明該縮足反應的確是痛行為。

為了研究傷害性施萬細胞調(diào)節(jié)感覺的模式，研究者將誘發(fā)動物行為的光遺傳閾下刺激，與冷、熱和機械刺激相結合。這時，閾下光刺激可以使生理刺激所調(diào)節(jié)的行為變得敏感。閾下刺激顯著增加了2 g von Frey 的行為反應；提高了Plp-ChR2 和Sox10-ChR2 小鼠對冷刺激的反應；但不影響棉簽引起的輕觸反應。在Sox10-ArchT 小鼠中，沉默傷害性施萬細胞不影響冷刺激的反應。在Plp-ChR2和Sox10-ChR2 小鼠，閾下光刺激增強了熱誘發(fā)縮足反應，但在Sox10-ArchT 小鼠沉默傷害性施萬細胞并不影響熱痛閾。通過增加閾下光刺激的時長，Plp-ChR2 小鼠的機械痛閾值表現(xiàn)出時間依賴性降低。在Sox10-ChR2 小鼠，沉默施萬細胞導致機械閾值顯著升高，24 h 后則恢復。

采用全細胞膜片鉗技術對表達Sox10-TOM 的傷害性施萬細胞電學性質(zhì)進行檢測。

當向細胞內(nèi)注入步階電流時，該細胞I-V 曲線在靜息膜電位周圍顯示出雙相線性關系，且在靜息電位周圍存在一個精確的拐點（靜息電位平均-32.56±1.36 mV）。該類細胞呈現(xiàn)去極化時阻抗降低，表明有內(nèi)在的離子通道打開，可將膜電位拉向靜息電位。被動膜電學特性表明該細胞具有在神經(jīng)元的范圍內(nèi)較慢的時間常數(shù)。

研究者還測量了傷害性的施萬細胞對機械刺激的電反應，以確定其是否具有機械活性。研究顯示，機械刺激可以使細胞產(chǎn)生瞬時的去極化(n = 9)。 其中4 個細胞可能由于機械力影響細胞的封接而沒有完全回到基線。剩余的5 個細胞中，在持續(xù)施加力的過程中細胞放電的衰減基本上是完全的，這表明機械感受性反應在持續(xù)力的作用下產(chǎn)生了適應。由于反應和適應都非常迅速，使隨后的刺激出現(xiàn)和前一個刺激類似的反應。這些細胞放電可以跟隨實驗者所給的最高刺激頻率(60 Hz)。此外，釋放機械力也可使細胞去極化，因此傷害性施萬細胞對力的正負變化都有反應，但對持續(xù)的力反應要弱得多。傷害性施萬細胞放電峰值平均幅度25.5±2.1 mV，半波寬6.7±1.5 ms，上升時間1.4±0.2 ms。機械感受器電位的這個時程說明有機械感受器電流產(chǎn)生的可能。因此這些參數(shù)提示傷害性施萬細胞存在類似于之前描述的感覺神經(jīng)元所屬的快的門控機制。

4. 討論

該研究為一種可以在皮膚上形成感覺器官、引起疼痛感覺的特殊類型的膠質(zhì)細胞提供了證據(jù)。該研究表明傷害性施萬細胞在表皮下的神經(jīng)周圍形成網(wǎng)狀的胞質(zhì)鞘，呈放射狀突起進入與無髓鞘傷害性神經(jīng)鄰接的表皮。傷害性施萬細胞相當于45 年前被忽略的位于表皮下邊界的Remak 施萬細胞。而在當時人們認為神經(jīng)纖維失去了膠質(zhì)附著，以游離神經(jīng)末梢的形式進入表皮。在這篇文章中，研究者證明傷害性施萬細胞具有高度的機械敏感性，對正和負的機械力刺激都有反應，與秀麗隱桿線蟲的“開-關”式機械感受器反應相似，可將傷害性刺激轉(zhuǎn)為電信號然后再轉(zhuǎn)化為類似疼痛的行為。皮膚中的傷害性神經(jīng)末梢也會對各種有害刺激產(chǎn)生反應。因此，傷害性神經(jīng)和傷害性施萬細胞形成一個傷害性膠質(zhì)-神經(jīng)復合體，這個復合體有兩種感覺受體細胞類型：膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞，都可能影響痛覺。大多數(shù)或所有類型的傷害性感受器似乎都參與了膠質(zhì)-神經(jīng)復合體的活動，而且在功能獲得性 (gain of function) 實驗中，機械性痛覺和熱痛覺都增強了。然而，在功能喪失性 (loss of function) 實驗中，小鼠的熱痛覺并不受影響，推測初級傳入神經(jīng)本身就有足夠的溫度敏感離子通道的激活，或者傷害性施萬細胞參與了研究者在實驗中沒有捕捉到的其他溫度敏感性行為。與溫度敏感性行為相反，小鼠機械閾值在功能性增加和功能性喪失的實驗中都受到了影響，說明傷害性施萬細胞在生理上對機械刺激的感覺起作用，這可能提示不同的傷害性神經(jīng)元類型的反應譜比分子譜預測得更為廣泛。如果不同的神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細胞傳導不同的溫度和機械刺激，如已知的默克爾細胞傳導非傷害觸覺，那么研究者的發(fā)現(xiàn)具有廣泛功能上的意義。

（Abdo H, Calvo-Enrique L, Lopez JM, et al. Specialized cutaneous Schwann cells initiate pain sensation. Science, 2019, 16, 365:696-699. 上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院，王婷婷 譯, 同濟大學醫(yī)學院，張玲 校）