張志博，劉義明，王玉鳳，張向陽，劉欣彤，王宏磊，徐 飛，路永強，陳孝杰，李秀波

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 國家飼料中藥物基準(zhǔn)實驗室，北京 海淀 100081；2.北京市畜牧總站，北京 朝陽 100029)

豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)能引起對豬的高度接觸性致死性傳染病，即豬瘟(Classical swine fever,CSF)[1]，嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)，是我國政府計劃消滅的重大動物傳染病之一。目前我國養(yǎng)豬模式多樣化，規(guī)模各異，各豬場的生物安全等級也不盡相同，因此在豬瘟疫情防控方面，面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[2]，生物安全防控是豬場防疫最直接的方式，采用有效的消毒劑是豬場的生物安全防控重點措施[3]。

二氧化氯消毒劑是被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為A1級安全高效消毒劑，其消毒具有廣譜性、高效性和安全性[4]。目前國內(nèi)外關(guān)于二氧化氯對病毒的滅活效果評價多集中在脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感病毒等病毒，如孫榮芳等[5]評估了二氧化氯對脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型、單純性皰疹病毒Ⅰ型和腮腺炎病毒等6種病毒的滅活作用；Ogata N等[6]通過小鼠感染試驗評估了二氧化氯對甲型流感病毒的滅活效果。但二氧化氯對豬瘟病毒的殺滅效果評價較少，導(dǎo)致二氧化氯應(yīng)用于豬場消毒時缺少參考依據(jù)，在臨床應(yīng)用時具有盲目性。因此本試驗采用免疫熒光法和懸液定量殺滅試驗，測定了一種二氧化氯溶液對Thiveral株豬瘟病毒的殺滅效果，并選取市面上使用的二氧化氯粉劑進(jìn)行消毒效果比較，以期為二氧化氯對豬瘟病毒的消毒標(biāo)準(zhǔn)提供參考與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試消毒劑 二氧化氯溶液：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所提供，批號:190401；二氧化氯粉劑：張家口市綠潔環(huán)保化工技術(shù)開發(fā)有限公司，批號:20181025。

1.2 細(xì)胞與毒株 豬瘟病毒Thiveral株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要試劑 抗小鼠IgG(全分子)-FITC山羊抗體，貨號:F9006-2 mL，購自Sigma公司；Triton X-100，購自Sigma公司；PBS緩沖液、MEM培養(yǎng)基、牛血清和青、鏈霉素，均購自上海阿拉丁生物科技有限公司；五水合硫代硫酸鈉，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 主要溶液配制 中和劑：含0.5%硫代硫酸鈉PBS溶液；標(biāo)準(zhǔn)硬水：每1 L去離子水中含0.304 g的無水氯化鈣和 0.139 g帶結(jié)晶水的氯化鎂；細(xì)胞生長培養(yǎng)液：含青、鏈霉素和10%牛血清的MEM培養(yǎng)基；細(xì)胞維持培養(yǎng)液：含青、鏈霉素和2%牛血清的MEM培養(yǎng)基。

1.5 主要儀器 熒光顯微鏡，上海蔡康光學(xué)儀器廠出產(chǎn)；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZWYR-D2403型恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；微量移液器，德國Eppendorf公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，蘇州威爾試驗用品有限公司。

1.6 PK-15細(xì)胞制備 取出凍存的PK-15細(xì)胞，置37 ℃水浴迅速解凍。室溫1 000 r/min離心3 min，棄去上清。用生長培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸后轉(zhuǎn)移至75 cm2培養(yǎng)瓶中，并補加適量生長培養(yǎng)液，置于含5% CO2的37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)36～48 h。待細(xì)胞長滿單層時，棄掉培養(yǎng)液，用PBS漂洗后加入適量胰酶，置于37 ℃消化2～3 min，輕拍瓶壁使細(xì)胞脫落。加入生長培養(yǎng)液，用移液器輕輕吹打使細(xì)胞分散，形成均勻的細(xì)胞懸液。接種于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補加生長培養(yǎng)液適量，置于含5% CO2的37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察，待細(xì)胞長滿單層時，可用于試驗。

1.7 Thiveral株豬瘟病毒液的制備 取凍存的豬瘟病毒Thiveral株置于37 ℃水浴迅速融化；按10%的體積接種已經(jīng)長滿單層PK-15細(xì)胞75 cm2培養(yǎng)瓶，置于含5% CO2的37 ℃ 培養(yǎng)箱中吸附1 h，期間每隔10～15 min晃動1次細(xì)胞瓶，使全部細(xì)胞被浸潤，防止細(xì)胞因干燥死亡；加入適量細(xì)胞維持液于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2溫箱中放置72 h；采用免疫熒光抗體試驗(FAT)檢測，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)亮綠色熒光時，表明病毒培養(yǎng)成功；然后反復(fù)凍融3次，使宿主細(xì)胞破碎，以釋放病毒，經(jīng)6 000 r/min離心15 min，保留上清，上清液即為所需的病毒懸液，將病毒懸液分裝。取3支病毒懸液，按Reed-Muench法計算該病毒滴度，病毒滴度達(dá)105.5TCID50/0.1 mL，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 中和劑試驗

1.8.1 消毒劑、中和劑、中和產(chǎn)物對PK-15細(xì)胞的影響 參照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》，主要目的是評估消毒劑、中和劑及中和產(chǎn)物(中和劑+消毒劑)對試驗用PK-15細(xì)胞的影響。以0.5%硫代硫酸鈉PBS溶液作為中和劑，消毒劑用無菌硬水稀釋為最大試驗濃度75 mg/L，試驗在(20±2)℃下進(jìn)行。分為4組，第1組：中和劑；第2組：中和產(chǎn)物(中和劑+消毒劑)；第3組：消毒劑；第4組：細(xì)胞對照[7]。

1.8.2 消毒劑、中和劑、中和產(chǎn)物對病毒的影響 參照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》，主要目的是評估消毒劑、中和劑及中和產(chǎn)物(消毒劑+中和劑)對試驗用病毒滴度的影響。以0.5%硫代硫酸鈉PBS溶液作為中和劑，消毒劑用無菌硬水稀釋為雙倍最大試驗濃度150 mg/L，試驗在(20±2)℃下進(jìn)行，試驗分為6組，第1組：病毒懸液+消毒劑；第2組：(病毒懸液+消毒劑)+中和劑；第3組：(標(biāo)準(zhǔn)硬水+病毒懸液)+中和劑；第4組：(消毒劑+中和劑)+病毒懸液；第5組：標(biāo)準(zhǔn)硬水+病毒懸液；第6組：不接毒細(xì)胞對照[7]。

1.9 病毒滅殺試驗 參照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》，評價消毒劑在不同濃度下，分別作用不同時間，對Thiveral株豬瘟病毒滅活效果。有機干擾物是含3%牛血清的PBS溶液，消毒劑用標(biāo)準(zhǔn)硬水分別稀釋為試驗可用濃度，設(shè)置2個時間梯度(3 min和5 min)。將0.5 mL病毒懸液和0.5 mL有機干擾物混勻，加入消毒劑4 mL，使混合液中消毒劑有效物質(zhì)濃度含量分別維持在6.25、12.5、25 mg/L和50 mg/L，20 ℃水浴作用至預(yù)定時間，取上述消毒產(chǎn)物0.1 mL加中和劑0.9 mL，混勻作用10 min。測定病毒滴度。用無菌硬水代替消毒劑作為陽性對照，進(jìn)行上述試驗[7]。

病毒滅活率=(陽性對照組病毒滴度-試驗組病毒滴度)÷陽性對照組病毒滴度×100%

2 結(jié)果

2.1 消毒劑、中和劑、中和產(chǎn)物對PK-15細(xì)胞的影響分析 試驗結(jié)果見中插彩版圖1，將0.5%硫代硫酸鈉的PBS作為中和劑，作用試驗細(xì)胞3 h，在光學(xué)顯微鏡下觀察，顯示細(xì)胞形態(tài)正常，生長狀況良好。將2種消毒劑與中和劑形成的中和產(chǎn)物作用試驗細(xì)胞3 h，均顯示細(xì)胞形態(tài)正常，生長狀況良好。試驗結(jié)果表明，中和劑與消毒劑和中和劑形成的中和產(chǎn)物對細(xì)胞生長無影響，與對照組相比并無明顯差異。

2.2 消毒劑、中和劑、中和產(chǎn)物對病毒的影響分析 試驗結(jié)果見表1，以0.5%硫代硫酸鈉PBS溶液作為中和劑中和這2種供試消毒劑，均顯示第1組無病毒生長，第2組與第1組相近且病毒含量遠(yuǎn)小于3、4、5組，3、4、5組的LogTCID50相近，第6組試驗細(xì)胞生長正常且無細(xì)胞病變。結(jié)果表明，此中和劑可有效中和這2種供試消毒劑對Thiveral株豬瘟病毒的殺滅作用，且中和劑與中和產(chǎn)物對Thiveral株豬瘟病毒和試驗細(xì)胞無明顯影響。因此，以0.5%硫代硫酸鈉PBS溶液作為中和劑符合要求。

表1 中和劑鑒定試驗結(jié)果

2.3 病毒滅殺試驗分析 如表2所示，有效濃度為25 mg/L二氧化氯溶液作用3 min，對Thiveral株豬瘟病毒滅活率達(dá)100%，滅活效果達(dá)標(biāo)；如表3所示，有效濃度為25 mg/L的二氧化氯粉劑溶解液作用3 min，對Thiveral株豬瘟病毒滅活率達(dá)100%，滅活效果達(dá)標(biāo)；試驗結(jié)果表明，二氧化氯溶液對Thiveral株豬瘟病毒殺滅效果良好，且與二氧化氯粉劑對Thiveral株豬瘟病毒殺滅效果相似，兩者濃度為25 mg/L時，均能殺滅Thiveral株豬瘟病毒。

表2 二氧化氯溶液對Thiveral株豬瘟病毒滅活效果

表3 二氧化氯粉劑對Thiveral株豬瘟病毒滅活效果

3 討論

本試驗的主要目的是研究一種二氧化氯溶液對豬瘟病毒的滅殺效果，為二氧化氯對豬瘟病毒的消毒標(biāo)準(zhǔn)建立參考與理論依據(jù)，對二氧化氯類消毒劑應(yīng)用于豬場消毒提供指導(dǎo)建議。Thiveral株豬瘟病毒是中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供的一種標(biāo)準(zhǔn)試驗性病毒，在豬瘟類病毒中有普遍的代表性，且具有繁殖力強、培養(yǎng)時間短等優(yōu)點，能夠有效地縮短試驗周期，因此試驗使用Thiveral株豬瘟病毒作為消毒對象[8]。采用精確的病毒檢測方法是提高試驗準(zhǔn)確性與科學(xué)性的前提，目前國際上對病毒含量檢測方法眾多，并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，主要的方法有細(xì)胞感染法[9]、雞胚感染法[10]、動物感染法[11]、熒光定量PCR[12]、RT-qPCR法[13]及免疫學(xué)等方法，本試驗將細(xì)胞感染法與免疫熒光法相結(jié)合，利用滅活前后的Thiveral株豬瘟病毒分別感染PK-15細(xì)胞，然后使用免疫熒光法測定PK-15細(xì)胞的病變反應(yīng)，此法能夠精確的測定出豬瘟病毒含量。

中和劑試驗證明了中和劑與中和產(chǎn)物對試驗細(xì)胞無影響，且對病毒滴度也沒有影響，可以進(jìn)行病毒滅殺試驗。病毒滅殺試驗表明，濃度為12.5 mg/L二氧化氯溶液作用3 min，對Thiveral株豬瘟病毒滅活率達(dá)96.84%，當(dāng)作用時間延長至5 min，對該病毒滅活率提高到99.11%；當(dāng)濃度提高到25 mg/L時，作用3 min，對該病毒滅活率達(dá)100%，能完全殺滅病毒。有效濃度為12.5 mg/L的二氧化氯粉劑溶解液，對Thiveral株豬瘟病毒作用3 min時，滅活率達(dá)99.07%，延長作用時間至5 min，對該病毒滅活率上升至99.25%；當(dāng)濃度提高到25 mg/L時，作用3 min，對該病毒滅活率也可達(dá)100%。試驗結(jié)果表明，二氧化氯溶液對Thiveral株豬瘟病毒殺滅效果良好，且與二氧化氯粉劑對Thiveral株豬瘟病毒殺滅效果相近，兩種消毒劑對該病毒的滅活效果相近的原因可能是由于兩者的有效成分均為二氧化氯。本試驗結(jié)果表明，二氧化氯對豬瘟病毒具有良好的滅活效果，對二氧化氯類消毒劑應(yīng)用于豬場消毒具有指導(dǎo)意義。

作為理想的消毒劑應(yīng)該滿足廉價、低毒和高效這三大基本要素。二氧化氯作為國際公認(rèn)的高效、無毒和安全的綠色消毒劑，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、制藥、畜牧、公共環(huán)境等多領(lǐng)域，具有滅菌、消毒、防霉、保鮮等用途[14]，二氧化氯溶液具有無殘留、穩(wěn)定性好、價格低等優(yōu)點，有廣闊的應(yīng)用前景。