王海寧，金珊珊，徐正中，2，王 蕾，焦新安，2，陳 祥，2

結核病是由結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTC)感染引起的全球十大傳染病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO發(fā)布的《2020年全球結核病報告》顯示，2019年全球約有1 000萬人患結核病，140萬人死亡[1]。此外，結核分枝桿菌多重耐藥(MDR)、廣泛耐藥(XDR)和完全耐藥(TDR)菌株的出現(xiàn)和傳播，使得結核病的治療和防控愈加艱難。因此，研究結核分枝桿菌的生理生化特性以及毒力相關基因的功能十分必要[2]，其中缺失株的構建則是關鍵環(huán)節(jié)之一。

但是結核分枝桿菌的生長十分緩慢，其倍增時間大約需要24 h，單菌落形成需要3到4周，這意味著多步遺傳操作中每一步耗時至少需要1個月，嚴重影響了結核病致病機制的深入研究。目前，基因敲除技術可以分為依賴于較長同源序列的同源重組、依賴于短同源序列的位點特異性重組以及不依賴于同源序列的轉座敲除等 3 種主要類型[3]。本文著重介紹了應用于結核分枝桿菌基因敲除的研究方法，并對幾種敲除技術進行了比較，見表1所示。

表1 分枝桿菌基因敲除技術的方法比較Tab.1 Comparison of methods of gene knockout in mycobacteria

1 特異性轉導法

為了提高分枝桿菌同源重組效率和降低非特異性重組，引入了分枝桿菌穿梭噬菌體這一遺傳操作。噬菌體遞送系統(tǒng)的一個重要優(yōu)點是細菌群體中的每個單菌落基本都可以被攜帶轉座子的噬菌體感染，產(chǎn)生大量獨立的突變體。1987年，Jacobs等首次提出了構建重組穿梭噬菌體的方法，該噬菌粒插入了分枝桿菌噬菌體DNA和大腸桿菌質粒，可以在分枝桿菌中作為噬菌體復制以及在大腸桿菌中作為質粒復制，并且可以將DNA在這兩種屬間轉移[4]。Snapper等利用噬菌體將外源DNA導入到分枝桿菌中，可產(chǎn)生能夠在大腸桿菌、恥垢分枝桿菌和卡介苗之間的穿梭質粒[5]。

隨后，Bardarov等[6]首次提出，特異性轉導是一種非常有效的分枝桿菌遺傳操作技術。其主要步驟為：首先，構建表達同源重組區(qū)的質粒。該質粒包含目的基因的同源區(qū)域、潮霉素抗性標記、識別位點、還包含一個PacI限制性酶切位點，λcos位點和大腸桿菌(OriE)的復制起點。其次，兩個載體通過PacI同時消化，將等位交換底物連接在含有溫敏型分枝桿菌噬菌體元件的穿梭載體上。成功連接的產(chǎn)物以恥垢分枝桿菌作為宿主細胞，經(jīng)電轉在30 ℃下形成噬菌斑，從而獲得噬菌體。隨后將噬菌體轉導到目標分枝桿菌菌株中，在37 ℃下進行雙交換。最后，通過潮霉素篩選出陽性克隆子并鑒定得到突變株。Bardarov等分別在恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG和結核分枝桿菌中構建突變株而證明了其實用性和可重復性[6]。Tufariello等[7]通過同樣的方法實現(xiàn)了結核分枝桿菌rpf樣基因的敲除。2014年，Jain等[8]改進了一些限速操作并構建了穿梭質粒phAE159，使其能夠容納更大的目的片段，通過改進的方法和質粒工具已經(jīng)產(chǎn)生上百個靶向突變株。2017年，Yang等[9]通過改良的特異性轉導策略成功構建了結核分枝桿菌H37Ra的sigB基因敲除株。Vanunu等[10]則使用基于phAE87的溫度敏感的特異性轉導噬菌體，在39 ℃下感染BCG 6 h后成功敲除fmt基因。盡管特異性轉導方法成功率高，但也存在操作繁瑣復雜這一主要缺點。

2 線性DNA片段法

通過線性DNA片段同源重組法獲得基因缺失株是常見的分子遺傳方法，已經(jīng)被廣泛應用于分枝桿菌和其他細菌中目的基因敲除的研究。其原理是將攜帶含有選擇標記的靶基因線性片段通過電轉法轉入到分枝桿菌中，從而破壞目標基因來獲得基因突變株。自20世紀90年代起，多篇文章相繼報道了使用該方法獲得分枝桿菌突變體的實例，例如，應用于編碼支原體轉移酶(mycolyl transferase)和纖維連接蛋白結合活性的fbpA和fbpB基因的靶向性斷裂，以及編碼超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)蛋白等影響分枝桿菌毒性的獨立相關基因[11-12]。其中短線性DNA片段(<5 kb)已經(jīng)被廣泛應用于不同分枝桿菌中基因突變株的構建[13-15]，而Balasubramanian等[16]則使用長線性片段進行同源重組。該策略是在結核分枝桿菌中利用長線性重組底物通過等位基因交換獲得重組子，產(chǎn)生長度約為40～50 kb的突變體。研究人員通過結果推測，相對于短線性DNA，長線性底物降解更慢，具有長線性重組底物的轉化頻率足夠高，可能更有利于同源重組。

目前，基于分枝桿菌噬菌體重組酶的重組系統(tǒng)因操作簡便具有較大的研究前景。尤其是基于分枝桿菌噬菌體Che9c重組酶gp60、gp61所構建的分枝桿菌重組工程體系，只需表達分枝桿菌噬菌體重組酶，無需繁瑣的體外操作。gp60和gp61基因的表達促進了恥垢分枝桿菌和結核分枝桿菌重組水平的提高[17]，使分枝桿菌突變株的構建更為方便。Tufariello等[18]通過利用噬菌體重組蛋白改進了該方法，在含有pJV53的CDC1551菌株中，觀察到了噬菌體Che9c重組蛋白的表達大大提高了噬菌體DNA與宿主染色體的同源重組效率。ssDNA重組可以促進分枝桿菌中各種不同的基因操作[19]。該方法可以有效地將已定義的點突變引入到恥垢分枝桿菌和結核分枝桿菌染色體中。Che9c gp61介導的ssDNA重組效率是分枝桿菌dsDNA重組效率的100～1 000倍。利用重組的各種技術已在大腸桿菌中得到證明[20-21]，而且這些技術中的大多數(shù)似乎適用于分枝桿菌。

通過長短線性化片段進行同源重組的方法為深入研究結核分枝桿菌提供了重要的技術支撐，但是同源重組率低以及較高的錯配率仍是該技術應用無法避免的局限性。

3 反選擇標記法

由于等位基因的雙交換發(fā)生頻率較低且存在非特異性重組，這種方法可能僅僅只能構建和鑒定出小部分等位基因交換突變體。因此，反選擇標記法通常有助于在一些遺傳學方案仍不完善的微生物菌株中構建突變株。目前可用于分枝桿菌的反選擇標記有pyrF[22]、sacB[23]、katG[24]和rpsL[25]。rpsL同源重組系統(tǒng)是基于在鏈霉素抗性宿主中編碼核糖體蛋白S12的野生型rpsL基因的表達，使用卡那抗性基因和rpsL的鏈霉素敏感等位基因進行選擇[25]。但是rpsL同源重組系統(tǒng)受限于需要菌株背景為鏈霉素抗性。

目前最常用的是sacB同源重組系統(tǒng)，其原理是基于在10%蔗糖濃度的情況下sacB(編碼果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢桿菌基因)的表達對分枝桿菌是致命的[26]。帶有sacB基因的載體進行蔗糖選擇的效率為100%，使等位基因交換突變體的選擇成為可能，同樣適用于兩步法選擇[23]。例如使用蔗糖反選擇載體將編碼分枝桿菌脲酶的ureC基因的滅活拷貝基因遞送到牛分枝桿菌BCG基因組中，通過兩步法在2%蔗糖中選擇進行等位基因交換的陽性突變株[27]。因此，該技術對于致病性分枝桿菌的遺傳分析非常有用。ts-sacB載體由于結合了sacB基因的反選擇性質和分枝桿菌熱敏復制起點，可在39 ℃下有效地進行蔗糖反選擇[28]。2011年Barkan等的研究指出[29]，大腸桿菌半乳糖激酶基因(galK)可作為恥垢分枝桿菌和結核分枝桿菌的可選擇標記物，其片段只有1.3 kb長，相比于sacB更容易進行克隆和基因操作。而galK與sacB聯(lián)合使用，無需對潮霉素進行反篩選，節(jié)約了時間和人工成本。最重要的是，研究證明結合sacB/蔗糖和galK/2-脫氧半乳糖(0.2%)的策略在選擇重組事件時是100%有效的。該系統(tǒng)進一步擴展了分枝桿菌遺傳操作的有效工具。

盡管這些方法已經(jīng)很好地用于構建結核分枝桿菌突變株，但是由于低水平的整合以及冗長的兩步法使得缺失株的構建在實際操作中很難成功實現(xiàn)。因此引入了序列特異性重組酶來提高切除標簽的效率。目前，在分枝桿菌中成功應用的特異性重組系統(tǒng)有來自于細菌噬菌體P1的Cre/loxP系統(tǒng)[30]、轉座子γδ的TnpR/res系統(tǒng)[31]、釀酒酵母的Flp/FRT系統(tǒng)[32]，以及基于內(nèi)源Xer重組酶(Xer-cise)的序列特異性重組酶系統(tǒng)。通過噬菌體重組蛋白與Cre/loxP系統(tǒng)的結合，得到雙交換突變株的效率為25%～62.5%，從雙交換突變株得到無痕缺失突變株的效率為100%[33]。而Xer-cise重組酶系統(tǒng)已應用到分枝桿菌中，構建未標記的缺失突變體和相關遺傳操作[34]。該方法依賴于內(nèi)源性重組酶，不需要引入和隨后去除攜帶外源基因的復制質粒，操作簡單實用，可以高效率地得到穩(wěn)定的無選擇標記突變株，值得進一步研究推廣。同樣是基于Xer-cise系統(tǒng)，Mao等[35]通過引入gfp基因修飾質粒，構建了含有多個限制性內(nèi)切酶位點的dif-Zeo-dif和dif-Hyg-dif表達盒，成功地敲除了恥垢分枝桿菌的四對毒素-抗毒素基因，實現(xiàn)了快速連續(xù)多基因敲除的技術手段，為分枝桿菌敲除株的構建提供了新的遺傳技術。

4 CRISPR基因敲除法

盡管分枝桿菌中的基因敲除和調(diào)控基因表達方面取得了一定的進展，但是其必須基因的直接失活仍然艱難。尤其是靶向單個基因或多個基因耗時久且難度較大。成簇規(guī)律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)技術則有可能克服其中的一些限制。生物信息學分析結果表明，在14個分枝桿菌中存在CRISPR結構且CRISPR-Cas(成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列及其相關蛋白)系統(tǒng)僅在結核分枝桿菌和牛分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)[36]。2013年Qi 等首次提出CRISPRi(CRISPR interference)技術并被開發(fā)應用于大腸桿菌中，基因抑制水平高達99.9%[37]，該技術已廣泛應用于抑制結核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、卡介苗等菌株的基因表達[38-41]。

Yan等[42]在2017年首次使用CRISPR-Cas12a(Cpf1)系統(tǒng)成功地在恥垢分枝桿菌中產(chǎn)生無標記物和無痕缺失。Cas12a是CRISPR-Cas系統(tǒng)中的一種V-a型內(nèi)切酶，是一種參與CRISPR RNA(crRNA)處理、靶位識別和DNA切割的雙核酸酶[43-44]。Cas12a和Cas9識別不同的靶位點，這使得能夠更精確地選擇切割靶點并引入所需的突變。研究通過構建一個表達土拉熱弗朗西斯菌(Francisellatularensis)的CRISPR結合蛋白Cpf1(FnCpf1)和重組蛋白gp60和gp61的雙質粒系統(tǒng)，利用Cpf1輔助的ssDNA重組，有效地將點突變引入到恥垢分枝桿菌的原間隔序列鄰近基序(Protospacer Adjacent Motif，PAM)和crRNA靶向區(qū)域，引入位點直接突變的效率高達80%，而敲除效率為45%～80%。Van Kessel等的研究表明，Cpf1輔助重組比無Cpf1的無標記重組(只有5%～10%的效率)具有明顯的優(yōu)勢[17]。

Sun 等[45]首次報道了使用CRISPR-FnCpf1輔助非同源性末端接合(NHEJ)技術對恥垢分枝桿菌進行基因組編輯，谷氨酸棒狀桿菌密碼子優(yōu)化的FnCpf1(FnCpf1_cg)作為一種Cas效應蛋白經(jīng)檢測并不影響細胞生長，而NHEJ修復途徑是一種錯誤傾向修復機制，用于在缺少修復模板的情況下修復斷裂的雙鏈DNA，易在連接位點發(fā)生插入和缺失突變[46]。研究基于一個質粒的CRISPR-FnCpf1輔助的NHEJ系統(tǒng)可以在7N+2 d內(nèi)進行N輪重復的基因組編輯，編輯效率高達70%。最近，Yan等[47]改進了基于CRISPR切割和NHEJ的修復途徑，來增加其修復活性，有效地在結核分枝桿菌中產(chǎn)生敲除突變體。更重要的是，這個系統(tǒng)在結核分枝桿菌中可以同時產(chǎn)生雙突變和大規(guī)模的遺傳突變。此外，在現(xiàn)有的方法很難對分枝桿菌進行基因編輯時，該方法可以很容易地產(chǎn)生基因敲除突變體。盡管CRISPR技術仍存在脫靶效應等缺點，但其對于研究未知功能的靶基因十分有效。

5 ORBIT法

2018年報道的ORBIT(oligonucleotide-mediated recombineering followed by Bxb1 integrase targeting)技術已成功運用于恥垢分枝桿菌基因敲除突變體的構建[48]，該技術結合了兩種高效的噬菌體重組系統(tǒng)——Che9-RecT重組系統(tǒng)[17,19]和Bxb1噬菌體整合酶系統(tǒng)[49]。首先，表達質粒包含Che9-RecT重組系統(tǒng)和Bxb1噬菌體整合酶系統(tǒng)，該質粒需要轉化到菌株中以制備靶向寡核苷酸ssDNA和非復制有效載荷質粒。然后，Che9c RecT退火酶通過同源重組將合成的靶向寡核苷酸(ssDNA)整合到染色體中，從而在染色體中的精確位置引入attP位點。Bxb1整合酶通過attP-attB位點特異性重組將有效載荷質粒整合到基因組中，在整合的有效載荷質粒的兩側創(chuàng)建attL和attR位點。在這個系統(tǒng)中，寡聚物的序列決定了插入位點的位置，質粒傳遞有效載荷。根據(jù)靶向寡核苷酸和運載質粒的特征，可以實現(xiàn)基因的缺失，插入或替換。如進行基因敲除，可設計寡核苷酸用attP位點替代靶基因。而對于C末端標簽，寡核苷酸設計為在基因的終止密碼子之前插入attP位點，然后使用運載質粒引入標簽。該系統(tǒng)已成功在恥垢分枝桿菌和結核分枝桿菌中高效地產(chǎn)生100多個基因的敲除及融合。

ORBIT系統(tǒng)在分子克隆構建方面具有相當大的優(yōu)勢[50]。首先，該系統(tǒng)只需設計一種化學合成的寡核苷酸，相比基于等位基因交換生成突變體的方法，不需要設計多對dsDNA底物，因此該方法非常適合構建突變體文庫。其次，該系統(tǒng)可通過在靶向寡核苷酸中設計唯一的DNA特異性序列來標記每個產(chǎn)生的突變體。此外，該系統(tǒng)可以利用不同運載質粒進行的多種修飾為功能篩選突變體文庫提供了新的可能性。但該系統(tǒng)也存在一定局限性，不適用于緩慢生長的分枝桿菌以及需要通過電轉引入靶向寡核苷酸和運載質粒等，進一步限制了其整體效率。

6 小結與展望

目前，分枝桿菌缺失株構建的方法涉及到了基于同源重組的長短線性底物、反選擇標記、特異性轉導等技術，而CRISPR技術及ORBIT系統(tǒng)在分枝桿菌研究中有巨大潛力。本文基于分子遺傳學，著重介紹了與轉座子文庫、反義RNA等引起分枝桿菌基因沉默有本質區(qū)別的基因敲除技術，并對幾種敲除技術進行了比較。

至今為止，結核病仍然嚴重威脅著人類的健康，其研究意義巨大，尤其是在分枝桿菌中進行基因突變來反向驗證基因的功能。雖然近年來分枝桿菌的基因敲除技術取得了一定成就，但是其效率相比于傳統(tǒng)細菌的遺傳操作仍有較大的提升空間，在今后的遺傳操作中仍需要開發(fā)更簡便快捷的敲除技術。

利益沖突：無