付文婷，胡學(xué)謙，繆紅

作者單位：1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200025；2上海市長寧區(qū)精神衛(wèi)生中心藥學(xué)部，上海 200050；3上海市黃浦區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海 200010

鮑曼不動桿菌是一類革蘭氏陰性、氧化酶陰性、專性需氧的條件致病菌［1-4］，該菌有多種耐藥基因，如超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended Spectrum Beta-Lactamases，ESBLS）、金屬酶、頭孢菌素酶或染色體介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶（AMPc酶）、氨基糖苷修飾酶等，在一定環(huán)境下可以對抗生素產(chǎn)生多重耐藥，甚至泛耐藥［5-6］。鮑曼不動桿菌是院內(nèi)獲得性感染的主要病原菌之一，常在重癥病人、免疫力低下或長期使用激素、廣譜抗菌藥物等病人中引起呼吸道、尿路、血液、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等部位的感染，而泛耐藥鮑曼不動桿菌（extensively drug-resistant acinetobacter baumannii，XDR-AB）更是重癥監(jiān)護病房（ICU）中引起醫(yī)院感染爆發(fā)和流行的主要條件致病菌［7-9］。研究發(fā)現(xiàn)XDR-AB對老一代抗菌藥多黏菌素E保持很高的敏感率［1，10］，因而多黏菌素E重新引起了臨床關(guān)注，但其腎毒性限制了他的應(yīng)用［11-13］。在新的有效抗菌藥物研發(fā)遲滯的情況下，尋求多黏菌素E與其他抗菌藥物聯(lián)合的給藥方案，顯得尤為迫切。

在前期工作中，我們篩選了對XDR-AB具有協(xié)同殺菌作用的抗菌藥聯(lián)合治療方案［14-15］。在此靜態(tài)殺菌實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，本研究于2016年10月至2017年11月從數(shù)學(xué)模型角度描述多黏菌素E與其他抗菌藥物聯(lián)用對XDR-AB的殺菌活性和殺菌作用的特點。

1 研究方法

1.1靜態(tài)殺菌曲線實驗本部分以多黏菌素E為研究對象，聯(lián)用藥物包括美羅培南、米諾環(huán)素和利福平等。四種鮑曼不動桿菌泛耐藥菌株分別編號為：09-95，09-1769，09-2092和10-548。根據(jù)最小抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果（表1）以及棋盤法實驗結(jié)果，選擇低于MIC的濃度進行組合進行靜態(tài)殺菌曲線實驗。

表1 各抗菌藥對泛耐藥鮑曼不動桿菌的最小抑菌濃度（MIC）/（mg/L）

各菌株均做8個實驗組，包括空白組、單用組（四組）和多黏菌素E聯(lián)用組（三組），各組的含藥液濃度見表2。分別于給藥前和給藥后2，4，6，8，10，12和24 h采樣，涂布平板并進行菌落計數(shù)。培養(yǎng)24 h時菌落計數(shù)較初始時刻降低3 log10單位時，認(rèn)為具有殺菌作用。培養(yǎng)12 h時，聯(lián)用組菌落計數(shù)相對于強效組分單用組下降≥2 log10或3 log10時，分別判為具有相加或協(xié)同殺菌作用。

1.2藥效學(xué)模型分析建立圖1所示的藥效學(xué)模型描述多黏菌素E及聯(lián)用藥物對XDR-AB的殺菌作用。細菌生長過程具有非線性特征，采用冪函數(shù)進行描述，γ和kin分別為冪指數(shù)和系數(shù)。細菌消亡過程符合一級動力學(xué)，kout為速率常數(shù)。X表示菌落計數(shù)。

表2 四種鮑曼不動桿菌泛耐藥菌株類型、分組情況及靜態(tài)殺菌曲線實驗藥物濃度

圖1 多黏菌素E與其他抗菌藥物聯(lián)用對鮑曼不動桿菌的藥效學(xué)模型結(jié)構(gòu)圖

藥物對細菌生長和消亡過程均有調(diào)節(jié)作用，分別用f2和f1表示。采用Emax模型描述藥物對細菌生長/消亡過程的調(diào)節(jié)作用，其中，藥效學(xué)參數(shù)Emax表示調(diào)節(jié)作用最大值，EC50為達到50%Emax時所需的藥物濃度，CA和CB表示藥物濃度。藥物的聯(lián)用采用相加式模型表述。此外，還引入指數(shù)模型描述抗菌藥對消亡過程促進作用的衰減（λ表示衰減速率），以模擬抗菌藥在使用過程中引起的異質(zhì)性耐藥。

多黏菌素E與其他抗菌藥物聯(lián)用對鮑曼不動桿菌的藥效學(xué)模型微分方程組（1）如下，X為菌落計數(shù)，A和B表示抗菌藥，f為傳遞函數(shù)。

模型的構(gòu)建分兩個階段進行：①利用對照組數(shù)據(jù)估算kin、kout和γ等參數(shù)；②綜合利用各藥物處理組數(shù)據(jù)估算Emax、EC50和λ等參數(shù)。采用非線性回歸擬合實驗數(shù)據(jù)，用MATLAB軟件（7.0版，美國Mathworks公司）中的最大似然法實現(xiàn)相應(yīng)計算。微分方程的解算通過調(diào)用ODE函數(shù)實現(xiàn)。模型的選擇根據(jù)赤池信息判據(jù)（AIC）進行。藥效學(xué)擬合的目標(biāo)函數(shù)為平均殘差分?jǐn)?shù)，擬合效果通過圖形進行直觀判斷。

1.3多黏菌素E殺菌效果分析在圖1所示的藥效學(xué)模型基礎(chǔ)上，探討藥物濃度變化對細菌凈生長能力（net growth）的影響。凈生長能力為細菌生長量與消除量之差，其中生長量和消除量依次為公式（2）右邊的第1項和第2項。以菌株09-1769為例，將多黏菌素E藥效學(xué)參數(shù)代入公式（2），分析濃度為0、0.05和3.50 mg/L時凈生長能力隨時間的變化。

對圖1所示的藥效學(xué)模型進行模擬，預(yù)測聯(lián)合用藥對鮑曼不動桿菌的殺菌效果。以菌株09-95為研究對象，分析多黏菌素E（0～0.5 mg/L）與美羅培南（0～16 mg/L）聯(lián)用時對細菌菌落計數(shù)的影響。

2 結(jié)果

2.1多黏菌素E與其他抗菌藥物聯(lián)用對XDR-AB的殺菌效果多黏菌素E單用殺菌效果不佳，給藥后6 h均出現(xiàn)細菌重生長。美羅培南、米諾環(huán)素和利福平單用時幾乎沒有殺菌作用。多黏菌素E與這三個抗菌藥聯(lián)用時有明顯的協(xié)同殺菌作用，給藥后12 h時大部分處理組的菌落計數(shù)降至2以下，至給藥24 h時也僅有微弱的重生長。所建立的藥效學(xué)模型較好地描述了多黏菌素E藥物聯(lián)用對鮑曼不動桿菌的殺菌作用，模型預(yù)測值與實測值基本吻合。見圖2。

反映XDR-AB生長的藥效學(xué)參數(shù)如表3所示。菌株09-2092的kin和kout均低于其他菌株，該菌的生長速率總體慢于其他細菌。菌株09-1769和10-548的冪指數(shù)γ高于其他菌株，這兩個菌株生長速率高于其他兩株，與圖2所示結(jié)果相符。

表3 反映鮑曼不動桿菌生長的藥效學(xué)參數(shù)

2.2多黏菌素E與其他抗菌藥物對XDR-AB生長和消亡過程的調(diào)節(jié)作用多黏菌素E及聯(lián)用藥物美羅培南、米諾環(huán)素和利福平的藥效學(xué)參數(shù)如表4所示。多黏菌素E對細菌生長過程的EC50值總體高于其他藥物，該藥對細菌生長過程的調(diào)節(jié)能力較弱；多黏菌素E對細菌消亡過程的EC50總體明顯低于其他藥物且Emax均為正值，同時λ值顯著高于其他藥物，該藥對細菌消亡過程具有促進作用且力度較強，同時該促進作用隨時間推移呈指數(shù)衰減。

多黏菌素E濃度對XDR-AB凈生長能力的影響如圖3所示。當(dāng)多黏菌素E濃度為0.05 mg/L時，細菌凈生長能力在給藥后3 h內(nèi)為負(fù)值；爾后細菌凈生長能力轉(zhuǎn)變?yōu)檎?。?dāng)多黏菌素E濃度增加至3.5 mg/L時，細菌凈生長能力始終為負(fù)值且隨時間推移逐漸趨于零。

多黏菌素E與美羅培南聯(lián)用對菌株09-95的殺菌效果預(yù)測如圖4所示。當(dāng)多黏菌素E濃度高于0.14 mg/L時，菌落計數(shù)等高線基本與橫坐標(biāo)平行。

3 討論

XDR-AB在臨床的感染率及對多種抗菌藥物的耐藥率逐年上升［16-17］，多黏菌素E可能是目前對XDR-AB最為有效的抗菌藥物之一［18-21］。多黏菌素E由于其較嚴(yán)重的腎臟毒性和神經(jīng)毒性幾乎被臨床停用［22-23］，可使用多黏菌素E與一種或多種抗菌藥物聯(lián)合治療降低其不良反應(yīng)［24］。

表4 各抗菌藥物對泛耐藥鮑曼不動桿菌生長和消亡調(diào)節(jié)作用的藥效參數(shù)

本研究藥效學(xué)模型研究顯示美羅培南、米諾環(huán)素和利福平單用時對XDR-AB幾乎沒有殺菌作用，而多黏菌素E與這三個抗菌藥聯(lián)用時有明顯的協(xié)同殺菌作用，可殺滅XDR-AB且無重生長。此研究提示臨床上可采用多黏菌素E與利福平、美羅培南或米諾環(huán)素聯(lián)用的給藥方案，藥物聯(lián)用有望降低多黏菌素E的給藥劑量，從而降低其毒性反應(yīng)。

此外，圖3所示的菌株凈生長能力-時間曲線顯示當(dāng)多黏菌素E濃度增加至3.5 mg/L時，細菌凈生長能力始終為負(fù)值且隨時間推移逐漸趨于零，說明細菌被殺滅且沒有出現(xiàn)重生長。可以設(shè)計抑制細菌重生長的給藥方案（即菌株凈生長能力始終為負(fù)值），達到治愈感染的目的。根據(jù)圖4所示當(dāng)多黏菌素E濃度高于0.14 mg/L時，此時增加美羅培南濃度能迅速增強殺菌效果（特別是美羅培南濃度低于4 mg/L時）。根據(jù)圖4多黏菌素E與美羅培南發(fā)揮協(xié)同殺菌作用的濃度范圍，有助于進一步設(shè)計動態(tài)殺菌實驗，為臨床給藥方案制定提供更多參考信息。

我們前期的體外聯(lián)合藥敏試驗并未研究多黏菌素E與含舒巴坦的復(fù)合制劑（或舒巴坦）等其他抗菌藥物對XDR-AB的體內(nèi)外聯(lián)合抗菌作用。因此多黏菌素E聯(lián)合其他抗菌藥物治療XDR-AB的體內(nèi)試驗，需要臨床藥代動力學(xué)或藥效學(xué)的進一步研究證實。

（本文圖2～4見插圖12-6）