張楊蕊

作者單位：鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州450000

2018年中國國家癌癥中心研究報告表明乳腺癌已經成為我國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，給社會和家庭造成沉重的經濟和心理負擔［1］。目前的國際公認的乳腺癌標準治療模式是以手術、放療及化療為主的綜合治療，但整體治療療效仍有待提高［2-6］。尋找與乳腺癌發(fā)生發(fā)展關系密切的基因和信號通路，對于確定新的乳腺癌治療靶點具有重要意義。研究表明DEAD-box（DDX）解螺旋酶與腫瘤細胞的增殖和發(fā)生發(fā)展密切相關［7］，DEAD-box解螺旋酶46，一般簡稱為DDX46（別名PRPF5或hPrp5），DDX46蛋白屬于DDX解螺旋酶家族成員之一，現有研究表明DDX46與結直腸癌［8］、慢性淋巴細胞白血?。?］、食管鱗癌［10］、骨肉瘤［11］等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療預后相關。目前尚未檢索到DDX46與乳腺癌的相關報道，DDX46在乳腺癌中的調控作用仍不清楚。本研究于2019年2—6月分析DDX46在人正常乳腺上皮細胞系和乳腺癌細胞系中的表達差異，應用短發(fā)夾RNA（shRNA）介導乳腺癌細胞的DDX46基因沉默，觀察沉默DDX46基因對乳腺癌細胞生長增殖和凋亡的影響，初步探討DDX46與乳腺癌的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1主要材料人正常乳腺上皮細胞系HBL100和乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3購于中國科學院細胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基購于上海經科化學科技有限公司，胎牛血清購于美國HyClon公司。慢病毒質粒Phelper1.0購于上海吉凱基因公司，實時熒光定量逆轉錄PCR（RT-qPCR）試劑購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）活性檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術公司，細胞凋亡檢測試劑盒購于杭州聯(lián)科生物技術有限公司。GAPDH抗體、Anti-DDX46抗體、半胱氨酸蛋白酶-3剪切體（cleaved Caspase-3）抗體、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）抗體和Bcl-2相關X蛋白（Bax）抗體均購于英國Abcam公司。

1.2細胞培養(yǎng)HBL100、MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3細胞均以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基（含1%青霉素和鏈霉素），并培養(yǎng)于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，48 h后消化傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 RT-qPCR Trizol法提取實驗各組細胞的總RNA，按照RT-PCR試劑盒標準步驟逆轉錄為cDNA后進行RT-qPCR實驗。DDX46的正向引物序列和反向引物序列分別為5’-AAAATGGCGAGAAGAGCAACG-3’和5’-CATCATCGTCCTCTAAACTCCAC-3’，產物擴增長度為110 bp；內參基因GAPDH正向引物序列和反向引物序列分別為5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’和 5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’，產物擴增長度為121 bp。將配置好的PCR反應溶液置于RT-qPCR儀上進行PCR擴增反應，采用 2-ΔΔCt法計算 DDX46 mRNA 的相對表達量［12-13］。

1.4慢病毒感染和細胞篩選參照文獻［14］中的實驗方法應用pSIH1慢病毒載體轉染shDDX46病毒和shGFP對照病毒，DDX46靶向敲低序列為5’-GATTGTGATTGAAGAAGAA-3’。以shDDX46病毒和shGFP對照病毒感染6孔板中的SK-BR-3細胞，48 h后加入1 mg/L嘌呤霉素進行篩選，直至親本細胞全部死亡，采用RT-qPCR法檢測重組慢病毒感染乳腺癌細胞后DDX46 mRNA的表達水平。根據慢病毒轉染情況將SK-BR-3細胞分為空白對照組（未轉染組）、陰性對照組（對照序列慢病毒感染組）和sh-DDX46組（DDX46-shRNA慢病毒感染組）。

1.5蛋白質印跡法（Western Blot）將各組SK-BR-3細胞裂解，提取樣品蛋白進行蛋白電泳，上樣量為每孔30μg蛋白，濃縮膠條件為50 min 80 V，分離膠條件為100 min 100 V，常規(guī)轉膜，封閉，加入DDX46、Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3一抗，一抗?jié)舛葹?∶200，4℃雜交過夜，二抗（1∶1 000）經37℃孵育4 h后，漂洗3次，在ECL發(fā)光液下顯影，使用ImageJ分析目標蛋白灰度值（取平均值），以目標蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示目標蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.6克隆形成實驗各組SK-BR-3細胞分別以500個/孔細胞接種于12孔培養(yǎng)板中，置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%二氧化碳）中培養(yǎng)12～14 d，根據培養(yǎng)基PH值的變化及時更換培養(yǎng)液，待培養(yǎng)孔中出現肉眼可見的細胞菌落時，終止培養(yǎng)。95%乙醇固定15 min，1%結晶紫染色液染色20 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，干燥后于顯微鏡下計算細胞形成克隆數（＞50個細胞的細胞集落為1個克隆），實驗重復3次。

1.7四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測細胞增殖活力各組實驗細胞以5 000個/孔細胞密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每組設3個復孔，分別于接種后培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h檢測點進行MTT實驗。每孔加入5 g/L MTT溶液20μL，培養(yǎng)箱中37℃孵育4 h后棄上清。每孔加入二甲基亞砜200μL，在搖床上震蕩10 min充分溶解。在多功能酶標儀上測定490 nm波長處的吸光度值。實驗重復3次。

1.8流式細胞儀檢測細胞凋亡收取各組細胞培養(yǎng)液上清和經胰酶消化的貼壁細胞，800 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS緩沖液，細胞的濃度調整為1×106/mL；取100μL細胞懸液，加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）進行雙熒光標記，室溫下避光孵育，30 min內于流式細胞儀檢測凋亡細胞所占的比例。

1.9統(tǒng)計學方法應用SPSS 21.0和GraphPad 8.0統(tǒng)計軟件進行實驗數據的分析和圖片處理。實驗中計量數據均以xˉ±s表示，采用單因素方差分析各組樣本均數之間的差異，多組間的兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1乳腺癌細胞中DDX46 mRNA表達高于正常乳腺細胞RT-qPCR結果表明，DDX46 mRNA在乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3和正常人乳腺上皮細胞系HBL-100中的相對表達量分別為（3.12±0.18）、（2.86±0.22）、（5.02±0.28）和（1.02±0.06），DDX46 mRNA在各乳腺癌細胞中的表達均明顯高于正常乳腺上皮細胞（P＜0.001），其中DDX46 mRNA在SK-BR-3細胞系中表達水平最高，故選擇SK-BR-3細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 shDDX46病毒感染可明顯降低SK-BR-3細胞中DDX46表達實時熒光定量PCR檢測結果表明，轉染48 h后，空白對照組、陰性對照組和sh-DDX46組的DDX46 mRNA相對表達量分別為（1.08±0.09）、（0.96±0.08）和（0.29±0.06），sh-DDX46組與空白對照組和陰性對照組的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），空白對照組與陰性對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.221）。蛋白質印跡法檢測結果（圖1）表明，轉染48 h后，空白對照組、陰性對照組和sh-DDX46組的DDX46蛋白相對表達量分別為（0.75±0.05）、（0.72±0.07）和（0.21±0.03），sh-DDX46組的DDX46蛋白表達水平明顯低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.001），而空白對照組與陰性對照組的DDX46蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.541）。

圖1 蛋白質印跡法檢測DEAD-box解螺旋酶46（DDX46）蛋白的表達水平

2.3沉默DDX46表達抑制乳腺癌細胞的生長增殖克隆形成實驗結果（圖2A）表明，空白對照組、陰性對照組和sh-DDX46組SK-BR-3細胞克隆形成數分別為（159±29.35）、（148±19.68）和（82±16.98），與空白對照組和陰性對照組相比，sh-DDX46組SKBR-3細胞克隆形成數顯著減少（P＝0.013；P＝0.027），空白對照組和陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.827）。MTT結果表明：24 h時空白對照組、陰性對照組和sh-DDX46組的吸光度值分別為（0.41±0.042）、（0.37±0.032）和（0.26±0.034），48 h時空白對照組、陰性對照組和sh-DDX46組的吸光度值分別為（0.68±0.062）、（0.65±0.035）和（0.36±0.043），72 h時空白對照組、陰性對照組和sh-DDX46組的吸光度值分別為（1.29±0.058）、（1.22±0.071）和（0.73±0.056），24 h、48 h和72 h各個時間點sh-DDX46組細胞的吸光度值均明顯低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），而空白對照組和陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示DDX46降表達可抑制乳腺癌SK-BR-3細胞的增殖活力，詳見圖2B。

2.4沉默DDX46表達促進乳腺癌細胞凋亡流式細胞學實驗結果（圖3）表明，空白對照組、陰性對照組和sh-DDX46組SK-BR-3細胞凋亡率分別為（4.21±1.65）%、（5.36±1.23）%和（10.21±2.39）%，與空白對照組和陰性對照組相比，sh-DDX46組SK-BR-3細胞凋亡率明顯增加（P＝0.007；P＝0.016），空白對照組和陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.723）。

2.5沉默DDX46表達對凋亡相關蛋白的影響應用蛋白質印跡法檢測凋亡通路相關蛋白Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3的表達水平結果（圖4、表1）表明sh-DDX46組SK-BR-3細胞Bcl-2的相對表達量明顯低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），Bax和cleaved Caspase-3表達明顯高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05），空白對照組和陰性對照組cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白相對表達量均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組細胞B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）和半胱氨酸蛋白酶-3剪切體（cleaved Caspase-3）蛋白的相對表達量/

表1 各組細胞B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）和半胱氨酸蛋白酶-3剪切體（cleaved Caspase-3）蛋白的相對表達量/

注：DDX46為DEAD-box解螺旋酶46。與sh-DDX46組比較，aP＜0.001

cleaved Caspase-3 0.14±0.03a 0.16±0.04a 0.47±0.06 50.517＜0.001組別空白對照組陰性對照組sh-DDX46組F值P值重復次數3 3 3 Bcl-2 0.91±0.08a 0.87±0.09a 0.31±0.04 62.914＜0.001 Bax 0.31±0.05a 0.28±0.02a 0.81±0.06 122.723＜0.001

3 討論

DDX解螺旋酶參與許多涉及RNA二級結構改變的細胞過程，如翻譯起始、核和線粒體剪接、核糖體和剪接體組裝，參與胚胎發(fā)育、精子形成、細胞生長和分裂。DDX46的編碼基因位于染色體5q31.1，DDX46蛋白是17S U2 snRNP復合體的組成部分，在mRNA剪接過程中起著非常重要的作用，DDX46與細胞增殖、分化、器官發(fā)育和調節(jié)機體免疫系統(tǒng)密切相關，并參與調節(jié)多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展［15-16］。本研究結果顯示，DDX46 mRNA在3種乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3中的表達均明顯高于正常乳腺癌上皮細胞，其中SK-BR-3細胞系表達水平最高，有類似的研究也發(fā)現在結直腸癌細胞［8，17］、食管鱗癌細胞［10］和骨肉瘤細胞［11］中DDX46 mRNA均呈高表達，另外，Lee等［9］的研究發(fā)現在DDX46在慢性淋巴細胞白血病組織中高表達，DDX46高表達與慢性淋巴細胞性白血病病人生存期不良有關，以上研究結論提示DDX46在多種癌和正常組織細胞中存在表達差異。

DDX46與結直腸癌、食管癌、骨肉瘤等惡性腫瘤細胞的增殖和凋亡相關。Li Ming等［8］的研究表明87%的結直腸腺癌病人核DDX46染色水平較高，與癌旁組織相比，結直腸癌組織中DDX46蛋白表達明顯增加。用DDX46 RNAi慢病毒沉默人結腸癌細胞中DDX46在的表達后，MTT及克隆形成實驗檢測細胞生長增殖明顯減少，DDX46沉默通過增加cleaved Caspase-3和cleaved PARP的表達導致凋亡誘導，DDX46對結直腸癌細胞增殖至關重要，是結直腸癌治療的潛在治療靶點。Li Bin等［10］、李斌等［18］通過shRNA干擾技術靶向沉默食管癌TE-1細胞DDX46表達，沉默DDX46可通過下調Akt/NF-κB信號轉導通路抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡。另有研究報道DDX46可通過調節(jié)的骨肉瘤SaOS2細胞中PI3K和Akt的磷酸化水平，影響骨肉瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和體內腫瘤的生長［11］。

圖4 沉默DEAD-box解螺旋酶46（DDX46）表達對凋亡信號通路相關蛋白的影響：A為各組應用蛋白質印跡法檢測細胞凋亡蛋白結果；B為各組細胞凋亡蛋白相對表達水平柱狀圖

與上述研究類似，本研究參考張淑芳等［14］的實驗方法，通過慢病毒shRNA轉染乳腺癌SK-BR-3細胞，建立穩(wěn)定細胞系，細胞克隆形成實驗和MTT實驗檢測表明沉默DDX46表達可顯著抑制乳腺癌細胞的增殖和生長，流式細胞術檢測發(fā)現DDX46基因沉默后乳腺癌細胞凋亡率明顯增加。凋亡是細胞維持內環(huán)境穩(wěn)定的重要方式，也是腫瘤細胞死亡的主要方式［19-20］。本研究應用蛋白質印跡法對凋亡通路蛋白進行檢測發(fā)現，沉默DDX46后可誘導凋亡通路中的抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調，促凋亡蛋白Bax表達增強，同時凋亡關鍵蛋白Cleaved Caspase-3表達上調，提示沉默DDX46可能通過調節(jié)凋亡通路蛋白的表達誘導乳腺癌細胞凋亡。

綜上所述，本研究結果表明DDX46在乳腺癌細胞系中高表達，沉默DDX46表達可抑制乳腺癌細胞的增殖，并通過調節(jié)凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3的表達促進細胞凋亡，凋亡信號通路可能是其作用機制之一。本研究不足之處在于只選用一種人乳腺癌細胞系，且只在細胞層面初步探討了DDX46的作用，在今后的研究中我們會對上述問題進行進一步研究，增加動物實驗及臨床預后分析，并對其相關作用機制進行深入探討。

（本文圖2，3見插圖12-5）