劉祥華，羅湘筠，李文倩

作者單位：湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬第一醫(yī)院（湖南省直中醫(yī)醫(yī)院）針灸科，湖南 株洲412000

近年來，隨著人們對體育競技的重視，出現(xiàn)超負荷運動損傷的人日益增加。長時間或大負荷運動后骨骼肌纖維會出現(xiàn)損傷，不僅會出現(xiàn)延遲性肌肉酸痛現(xiàn)象同時會伴隨肌力下降，嚴重影響正常生活［1］。研究表明：超負荷運動后，會使得骨骼肌細胞膜結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)的肌酸激酶進入血液循環(huán)，使得肌酸激酶可以作為骨骼肌微細損傷的重要指標［2］?，F(xiàn)階段有生物或化學(xué)藥物改善超負荷運動導(dǎo)致的骨骼肌損傷，但這些藥物會在體內(nèi)留下代謝垃圾甚至有一定的毒副作用［3］。針灸是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)治療方式，相對藥物治療具有一定的優(yōu)勢［4］。尚畫雨等［5］研究證明：針刺可以緩解超負荷運動后的延遲性肌肉酸痛，同時具有促進骨骼肌恢復(fù)的效果。劉曉然等［6］研究證明：針刺可以有效抑制超負荷運動后骨骼肌骨架蛋白的解聚或降解，并加強骨架蛋白的合成代謝。本研究于2018年12月至2019年6月進行，旨在研究針刺足三里、陽陵泉、內(nèi)關(guān)和腎俞穴等穴位對超負荷運動致骨骼肌損傷大鼠氧化應(yīng)激損傷及骨骼肌細胞凋亡的影響，以期了解針刺對超負荷運動致骨骼肌損傷大鼠氧化應(yīng)激損傷及骨骼肌細胞凋亡的作用機制，從而為超負荷運動致骨骼肌損傷的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物SPF級6周齡SD大鼠60只，購于湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物合格證號：SYXK（湘）2017-0054；醫(yī)學(xué)實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2016-0004，所有SD大鼠分12個籠子飼養(yǎng)，每個籠子5只。所有SD大鼠均在湖南省直中醫(yī)醫(yī)院動物中心實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度20～25℃，相對濕度50%～65%，本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1.2藥物與試劑丙二醛、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）和琥珀酸脫氫酶（Succinic acid dehydrogenase，SDH）試劑盒均購于上海恒遠生物科技有限公司；肌酸激酶試劑盒子購于北京吉美生物技術(shù)有限公司；蘇木素、伊紅購于武漢博士得生物有限公司；中性甲醛、乙醇、二甲苯購于天津科密歐有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）凋亡檢測試劑盒購于杭州四季青生物工程材料有限公司；B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）等一抗蛋白購于美國Santa Cruz公司；蛋白抑制劑、辣根過氧化物酶（HRP）羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗蛋白購于美國Thermo公司。

1.3儀器BS-124s型電子天平購于北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；TGL-16M低溫離心機購于濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；SG-51正置型金相顯微鏡購于上海光學(xué)儀器廠；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購于美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購于以色列DNR公司；LD-66實驗室切片機購于長沙益廣制藥機械公司；流式細胞儀購于賽默飛世爾科技有限公司。

1.4方法

1.4.1 分組及超負荷運動 將60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法分為四組：空白組（Control，C）、超負荷運動組（Overload，O）、針刺組（Acupuncture，A）和超負荷運動+針刺組（Overload and Acupuncture，OA），每組各15只；空白組不做任何處理；超負荷運動組和超負荷運動+針刺組均建立超負荷運動模型，具體操作如下：在100 cm×100 cm×100 cm的游泳池中，注入70 cm深的水，保持溫度在32～35℃，每次持續(xù)訓(xùn)練120 min，訓(xùn)練前60 min讓SD大鼠適應(yīng)水性，后60 min負重大鼠體質(zhì)量5%的重物，第2周開始120 min均讓大鼠負重其體質(zhì)量8%的重物。

1.4.2 針刺干預(yù) 各組SD大鼠針刺按照2003年《實用動物針灸手冊》［7］標準，在超負荷運動后針刺SD大鼠雙側(cè)足三里、陽陵泉、內(nèi)關(guān)和腎俞穴，每日1次，每次留針20 min。

1.5檢測項目

1.5.1 氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)檢測 各組SD大鼠完成針刺干預(yù)后12 h內(nèi)，使用腹腔注射10%水合氯醛麻醉，行頸部脫臼處死，頸動脈采血并保存在-80℃超低溫冰箱中，后續(xù)實驗使用；切下SD大鼠骨骼肌，使用0.9%氯化鈉溶液沖洗，剪碎置于勻漿器內(nèi)勻漿，研磨后轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，在4℃恒溫下，以3 700 r/min，離心5 min，取沉淀使用超聲破碎儀破碎線粒體并加入倒入1.5 mL裂解液，使用丙二醛、SOD、GSH-Px、SDH試劑盒，嚴格按照試劑盒操作進行檢查其水平。

1.5.2 血清中肌酸激酶活性檢測 取上述各組SD大鼠血清，在4℃的恒溫離心機中以3 000 r/min速度離心10 min，按照肌酸激酶試劑盒子操作說明書方法檢測各組SD大鼠血清中肌酸激酶含量水平。

1.5.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 取SD大鼠骨骼肌，使用剪刀剪碎，使用胰蛋白酶消化成單層細胞后，使用恒溫離心機保持4℃，離心5 min收集細胞；收集細胞后加入100μL結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）重懸細胞并加入5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙啶（PI），輕輕混勻；室溫避光孵育15 min并加入400μL Binding Buffer使用流式細胞儀檢測SD大鼠骨骼肌細胞凋亡情況。

1.5.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測蛋白表達水平 使用蛋白質(zhì)印跡法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Akt、P-Akt、PI3K蛋白，取大鼠骨骼肌，使用胰蛋白酶消化后，提取總蛋白，使用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗，二抗，孵育2 h，以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

1.5.5 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠骨骼肌情況 HE染色觀察大鼠骨骼肌，使用二甲苯浸泡、不同梯度乙醇脫水、蘇木精浸泡、鹽酸乙醇分化、沖洗、伊紅染色、乙醇浸泡、二甲苯浸泡后中性樹膠封片即并在400倍的光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠骨骼肌組織情況。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法研究數(shù)據(jù)分析采用軟件為SPSS 22.0，作圖采用軟件為GraphPda Prism5，計量資料采用xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析，當組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，采用SNK方法進行進一步的多重比較，若P＜0.05則表明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，本研究所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠氧化應(yīng)激情況由表1可以看出，相比空白組，超負荷運動組大鼠丙二醛水平顯著升高，GSH-Px、SOD、SDH水平顯著降低（P＜0.05）；相比超負荷運動組，超負荷運動+針刺組大鼠丙二醛水平顯著降低，GSH-Px、SOD、SDH水平顯著升高（P＜0.05）；相比超負荷運動組，針刺組大鼠丙二醛水平顯著降低，GSH-Px、SOD、SDH水平顯著升高（P＜0.05）；相比針刺組，超負荷運動+針刺組大鼠丙二醛水平顯著升高，GSH-Px、SOD、SDH水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果/

表1 各組大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果/

注：GSH-Px為谷胱甘肽過氧化物酶，SOD為超氧化物歧化酶，SDH為琥珀酸脫氫酶。與空白組相比，aP＜0.01；與超負荷運動組相比，bP＜0.01；與針刺組相比，cP＜0.01

SDH/（kU/L）35.75±8.78 10.58±6.50a 31.25±5.50b 24.28±4.99bc 41.517＜0.001組別空白組超負荷運動組針刺組超負荷運動+針刺組F值P值鼠數(shù) 1 5 15 15 15丙二醛/（mol/L）4.75±0.29 13.97±0.55a 4.99±0.32b 7.89±0.41bc 1 681.193＜0.001 GSH-Px/（kU/L）142.25±8.39 55.68±6.97a 130.25±7.14b 135.58±8.14bc 416.066＜0.001 SOD/（kU/L）2.50±0.25 1.02±0.17a 2.38±0.30b 2.10±0.21bc 121.047＜0.001

2.2各組大鼠骨骼肌凋亡情況相比空白組，超負荷運動組大鼠Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；相比超負荷運動組，針刺組大鼠Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；相比針刺組，超負荷運動+針刺組大鼠Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；相比超負荷運動組，超負荷運動+針刺組大鼠Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。相比空白組，超負荷運動組大鼠骨骼肌細胞凋亡水平顯著升高（P＜0.05）；相比超負荷運動組，針刺組大鼠細胞凋亡水平顯著降低（P＜0.05）；相比針刺組，超負荷運動+針刺組大鼠細胞凋亡水平顯著升高（P＜0.05）；相比超負荷運動組，超負荷運動+針刺組大鼠骨骼肌細胞凋亡水平顯著降低（P＜0.05）。見表2、圖1、圖2。

2.3各組大鼠骨骼肌損傷情況由圖3可以看出，相比空白組大鼠腸骨骼肌肌肉組織正常，肌外膜完整，可見血管及神經(jīng)；肌束膜包裹肌纖維，肌纖維完整，肌細胞核大小形態(tài)未見異常；超負荷運動組大鼠骨骼肌肌肉組織肌纖維彎曲，肌紅蛋白溶解，肌細胞核固縮、溶解，肌束膜破裂；針刺組大鼠腸骨骼肌肌肉組肌正常肌肉組織，肌外膜完整，可見血管及神經(jīng)；超負荷運動+針刺組大鼠少量肌纖維斷裂溶解彎曲，余未見異常。相比空白組肌酸激酶水平（457.54±45.02）kU/L，超負荷運動組大鼠血清肌酸激酶水平顯著升高至（1 985.50±88.87）kU/L；相比超負荷運動組肌酸激酶水平，超負荷運動+針刺組大鼠肌酸激酶水平顯著降低至（1 402.51±64.50）kU/L（F＝485.60，P＜0.001）。

表2 各組大鼠骨骼肌凋亡檢測結(jié)果/

表2 各組大鼠骨骼肌凋亡檢測結(jié)果/

注：Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2，β-actin為β-肌動蛋白，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，Caspase-3為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。與空白組相比，aP＜0.01；與超負荷運動組相比，bP＜0.01；與針刺組相比，cP＜0.01

細胞凋亡率/%9.89±1.02 32.58±3.50a 11.52±1.02b 22.58±2.51bc 323.283＜0.001組別空白組超負荷運動組針刺組超負荷運動+針刺組F值P值鼠數(shù) 1 5 15 15 15 Bcl-2/β-actin值1.62±0.20 0.41±0.10a 1.25±0.15b 0.82±0.09bc 204.690＜0.001 Bax/β-actin值0.55±0.09 1.59±0.19a 0.56±0.10b 1.52±0.18bc 231.524＜0.001 Caspase-3/β-actin值0.35±0.08 1.53±0.25a 0.52±0.09b 1.38±0.18bc 194.899＜0.001

注：Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，Caspase-3為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，β-actin為β-肌動蛋白，C為空白組，O為超負荷運動組，A為針刺組，OA為超負荷運動+針刺組

2.4各組大鼠PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白表達情況由表3、圖4可以看出；相比空白組，超負荷運動組大鼠PI3K、p-AKT、m-TOR蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；相比超負荷運動組，針刺組大鼠PI3K、p-AKT、m-TOR蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；相比針刺組，超負荷運動+針刺組大鼠PI3K、p-AKT、m-TOR蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；相比超負荷運動組，超負荷運動+針刺組大鼠PI3K、p-AKT、m-TOR蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。各組Akt水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白表達情況/

表3 各組大鼠PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白表達情況/

注：PI3K為磷脂酰肌醇3-激酶，β-actin為β-肌動蛋白，Akt為蛋白激酶B，p-AKT為磷酸化蛋白激酶B，m-TOR為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白。與空白組相比，aP＜0.01；與超負荷運動組相比，bP＜0.01；與針刺組相比，cP＜0.01

mTOR/β-actin值1.55±0.25 0.51±0.20a 1.54±0.18b 1.32±0.21bc 81.006＜0.001組別空白組超負荷運動組針刺組超負荷運動+針刺組F值P值鼠數(shù) 1 5 15 15 15 PI3K/β-actin值1.61±0.20 0.75±0.15a 1.55±0.18b 1.18±0.14bc 82.528＜0.001 Akt/β-actin值1.02±0.12 1.03±0.11 1.01±0.10 1.03±0.11 0.113 0.952 p-AKT/β-actin值1.60±0.22 0.45±0.14a 1.53±0.21b 1.30±0.20bc 110.427＜0.001

圖4 各組大鼠PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白表達情況

3 討論

針刺是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)治療方法，使用針刺治療骨骼肌已有較長歷史且療效顯著［8］。使用針刺穴位可以將局部刺激信號通過組織間機械力的傳導(dǎo)傳遞給周邊組織，使得機體產(chǎn)生一系列的反應(yīng)，例如脂質(zhì)過氧化、線粒體游離鈣的聚積、改變線粒體內(nèi)膜通透性等［9］。本實驗探究通過使用針刺超負荷運動致骨骼肌損傷大鼠足三里、陽陵泉、內(nèi)關(guān)和腎俞穴，檢測器氧化應(yīng)激損傷及骨骼肌細胞凋亡情況，初步了解針刺超負荷運動致骨骼肌損傷的治療機制。傳統(tǒng)中醫(yī)認為：足三里、腎俞兩穴位可以平衡陰陽，益精補腎增加體能，具有保健作用［10］。針刺腎俞穴可以加強機體的抗氧化能力，減少自由基的累積，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)實現(xiàn)陰陽平衡。陽陵泉穴歸屬足少陽膽，內(nèi)關(guān)穴是手厥陰心包經(jīng)的常用腧穴之一，針刺這兩個穴位可以有效刺激免疫系統(tǒng)，同時具有養(yǎng)心安神、醒神開竅的作用［11］?？梢允沟贸摵蛇\動后快速恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，使用針刺后大鼠骨骼肌均未出現(xiàn)肌紅蛋白溶解，肌細胞核固縮、溶解，肌束膜破裂等情況，且骨骼肌微細損傷的重要指標肌酸激酶含量水平也顯著降低，說明使用針刺可以有效緩解大鼠超負荷運動后骨骼肌的損傷。這可能是因為刺激足三里、腎俞可以調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)陰陽平衡、益精補腎，增強大鼠對氧自由基的抵抗能力增強，同時調(diào)節(jié)骨骼肌線粒體內(nèi)膜的鈣離子平衡，達到保護骨骼肌線粒體外模及增加抗疲勞能力，實現(xiàn)保護超負荷運動后骨骼肌的效果。

超負荷運動后氧化應(yīng)激是導(dǎo)致骨骼肌細胞損傷造成細胞損傷的重要因素之一［12］。在健康的細胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，但是超負荷運動后會產(chǎn)生大量的活性氧，對細胞膜造成損傷，同時還會導(dǎo)致上皮細胞膜通透性增，使得細胞內(nèi)的SOD、GPX等酶釋放至細胞外［13］。丙二醛的含量可以反映機體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化的程度，使自由基與生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)并使得氧化產(chǎn)物分解［14］。SOD具有抗氧化性，是經(jīng)典的抗氧化酶之一，可以有效清除活性氧。機體內(nèi)SOD水平越高說明機體清除活性氧的能力越強，當腦組織損傷時其含量會顯著降低［15］。SDH是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，可連接氧化磷酸化與電子傳遞，在有氧運動中起著關(guān)鍵的作用。SDH主要分布在線粒體中，為有氧呼吸提供電子，其活性直接影響著能量代謝的過程，SDH活性增強，組織的氧利用能力就會提高。本研究中發(fā)現(xiàn)，相比超負荷運動組，使用針刺后丙二醛水平顯著降低，GSH-Px、SOD、SDH水平顯著升高。說明使用針刺有效降低大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激，這可能是因為通過針刺物理刺激大鼠足三里、陽陵泉、內(nèi)關(guān)和腎俞穴等穴位后使得大鼠的增強線粒體SOD活性增強，其消除自由基的能力也顯著增強，并且減少了運動中的氧化應(yīng)激，從而減輕了大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化；保護了線粒體膜，抑制了骨骼肌線粒體游離鈣的聚積，反之進一步抑制脂質(zhì)過氧化作用，實現(xiàn)有效降低大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。孫嫘等［16］研究表明：針刺可以有效降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，與本研究得出的結(jié)論相類似。

骨骼肌細胞凋亡在大鼠超負荷運動致骨骼肌損傷中起著關(guān)鍵的作用，而骨骼肌的凋亡受相關(guān)基因的調(diào)控［17］。Bcl-2家族是一種常見的凋亡控制基因。Bcl-2家族中主要是由Bcl-2和Bax這兩種蛋白表達量決定細胞是否凋亡［18］。Bax和Bcl-2表達呈相反趨勢，當Bcl-2表達下降時Bax表達上升，此時會促進細胞的凋亡；當Bcl-2表達升高，而Bax表達降低時，則會抑制細胞的凋亡。除了Bcl-2家族，Caspase家族的Caspase-3、Caspase-9等是重要的凋亡因子［19］。Caspase家族主要執(zhí)行凋亡基因為Caspase-3，其機制依靠凋亡因子啟動子作用有活性的Caspase-9使得proCaspase-3產(chǎn)生有活性的Caspase-3。并通過剪切另外的Caspase底物，達到引起級聯(lián)反應(yīng)的目的最終導(dǎo)致細胞凋亡［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，相比高負荷運動組，OA組大鼠Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著降低。這可能是因為超負荷運動后大鼠骨骼肌細胞膜受到損傷后鈣離子會大量進入細胞內(nèi)會引起骨骼肌肌原纖維的損傷，同時抑制線粒體的氧化代謝酶、激活細胞內(nèi)凋亡因子的產(chǎn)生，抑制抑凋亡因子的產(chǎn)生，引發(fā)細胞的凋亡。陳英華、郝志平［21］研究表明：針刺可以升高Bcl-2陽性細胞表達并降低Bax陽性細胞表達，與本研究得出的結(jié)論相類似。

PI3K/Akt即磷脂酰肌醇-3-/蛋白激酶，這條信號通路在調(diào)控細胞的凋亡中發(fā)揮重要的作用。劉玫梅等［22］研究表明：PI3K活化后的Akt可作用于Bcl-2、Bax等底物，抑制細胞凋亡從而保護骨骼肌細胞。本研究發(fā)現(xiàn)，相比超負荷運動組，超負荷運動+針刺組大鼠PI3K、p-AKT、m-TOR蛋白水平顯著升高。這可能是因為刺激大鼠的足三里、陽陵泉、內(nèi)關(guān)和腎俞穴后，促進了PI3K/Akt信號通路，促進Akt的磷酸化，并進一步干預(yù)其下游相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達，實現(xiàn)抑制超負荷運動后骨骼肌的凋亡。陳玄等［23］研究表明：使用電針刺激足三里和上巨虛減少骨骼肌細胞的凋亡，與本研究得出的結(jié)論相類似。

綜上所述，針刺可以通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路抑制大鼠氧化應(yīng)激和骨骼肌細胞凋亡實現(xiàn)治療超負荷運動致骨骼肌損傷。其作用機制可能是通過針刺調(diào)控PI3K-Akt信號通路實現(xiàn)促進其下游的抑凋亡因子的表達，實現(xiàn)抑制骨骼肌的凋亡，同時抑制大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。但本研究仍存在不足之處，本研究使用的針刺方法較為單一，在后續(xù)的實驗中將進一步使用不同針刺方法及針刺不同穴位，觀察其作用效果。

（本文圖2，3見插圖12-4）