徐漢杰，張雨，鄭圣霞，劉雨生，吳大保，趙衛(wèi)東

作者單位：1中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院），a婦產(chǎn)科，b生殖醫(yī)學(xué)中心，安徽 合肥230001；2安徽省婦幼保健院婦產(chǎn)科，安徽 合肥230001

隨著輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)階段體外受精和胚胎移植一個周期后的妊娠率高達(dá)60%，但仍有相當(dāng)一部分病人出現(xiàn)反復(fù)胚胎移植失?。≧epeated Implantation Failure，RIF）。2005年歐洲人類生殖及胚胎協(xié)會將RIF定義為3次以上高質(zhì)量胚胎移植而未妊娠或多次胚胎移植中，合計移植＞10個胚胎仍未妊娠［1］。常見原因是基因異常、內(nèi)分泌功能障礙、血栓性疾病、自身免疫性疾病、黃體功能不全，但仍有一部分病人無法找到病因［2］。近年，越來越多的生殖遺傳學(xué)家認(rèn)為慢性子宮內(nèi)膜炎（Chronic Endometritis，CE）與RIF的發(fā)生密切相關(guān)［3-5］。

CE是一種發(fā)生在子宮內(nèi)膜的慢性炎癥，大多數(shù)病人無臨床癥狀或僅表現(xiàn)為異常子宮出血、盆腔疼痛等輕微癥狀，其診斷的必備條件為在子宮內(nèi)膜間質(zhì)中存在漿細(xì)胞［6-7］。在實際工作中，采用傳統(tǒng)的蘇木精-伊紅（HE）染色難以區(qū)分漿細(xì)胞與單核細(xì)胞及子宮內(nèi)膜間質(zhì)的成纖維細(xì)胞，已有大量研究指出，白細(xì)胞分化抗原38（Cluster of Differentiation 38，CD38）、白細(xì)胞分化抗原138（Cluster of Differentiation 138，CD138）能特異的表達(dá)在漿細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜表面，為CE的診斷提供新的策略。但CE病人無癥狀或臨床癥狀輕微以及子宮內(nèi)膜組織取材的局限性，導(dǎo)致CE的準(zhǔn)確診斷率仍不高。本研究擬初步了解CE在RIF病人中的患病率，同時探討CD38、CD138免疫組化聯(lián)合宮腔鏡檢查診斷CE的應(yīng)用價值，為CE的診斷提供新的策略。

1 資料與方法

1.1一般資料選取中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院2017年2月至2019年6月RIF病人，納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜40歲，彩超及子宮輸卵管造影未見明顯異常，行3次或以上胚胎移植失敗或至少累積移植6個高質(zhì)量的胚胎失敗。排除標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)周期第3天卵泡刺激素（Follicle-Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）＞10 UI/L、體質(zhì)量指數(shù)（Body Mass Index，BMI）＞30 kg/m2、反復(fù)流產(chǎn)史、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜結(jié)核、黏膜下肌瘤、宮腔粘連、子宮內(nèi)膜異位囊腫、子宮腺肌癥、免疫性疾病。以上所有病人簽署宮腔鏡檢查知情同意書并在卵泡期（月經(jīng)干凈3～7 d）行宮腔鏡檢查及子宮內(nèi)膜活檢術(shù)，取出的子宮內(nèi)膜組織行HE染色及CD38、CD138免疫組化染色，研究方案經(jīng)安徽省立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（P-019），所有入組病人已完成必要的輔助檢查，并簽署知情同意書。

1.2宮腔鏡檢查方法病人取截石位，用碘伏消毒外陰及陰道，鋪無菌洞巾，再次消毒宮頸外口，避免擴(kuò)宮，連接宮腔鏡檢查鏡，全面觀察宮腔，然后觀察子宮內(nèi)膜是否存在CE征象：子宮內(nèi)膜點狀、局灶性或者彌漫性充血、子宮內(nèi)膜細(xì)小息肉、子宮內(nèi)膜血管增粗、子宮內(nèi)膜黏膜水腫等［8-9］，可予以定點活檢，若未見明顯異常，可予以分散活檢3～5處子宮內(nèi)膜，獲取子宮內(nèi)膜組織。

1.3免疫組織化學(xué)檢測CD38、CD138的表達(dá)使用10%的中性甲醛固定，常規(guī)脫水后行石蠟包埋，按2～4μm厚度連續(xù)切片，60℃烤箱過夜后脫蠟至水，制作成切片分別進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)染色，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（Streptavidin-Perosidase，SP）法，乙醇梯度脫水后蒸餾水洗，加入檸檬酸抗原高壓修復(fù)，高壓鍋冒汽后2 min，室溫冷卻，3%的過氧化氫封閉10 min，加CD38抗體（1∶1 500；HPA022132，Sigma）或 CD138（1∶100；CM167CK，Biocare Medical），4 ℃冰箱過夜，磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）沖洗，加通用型二抗（PV6000工作液），DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹脂封片。用PBS液作為一抗為陰性對照。

1.4結(jié)果判定CD38定位于細(xì)胞膜，出現(xiàn)棕黃色為陽性，CD138定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，出現(xiàn)棕黃色為陽性。在高倍鏡視野下發(fā)現(xiàn)有1個以上細(xì)胞CD38陽性，同時在相同高倍鏡視野下發(fā)現(xiàn)有1個以上細(xì)胞CD138表達(dá)陽性，診斷為組織病理學(xué)CE［10］。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料采取例數(shù)（%）表示。本研究以免疫組化診斷結(jié)果為參考，計算宮腔鏡診斷靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值等指標(biāo)，并對比宮腔鏡檢測結(jié)果與免疫組化診斷結(jié)果的一致性（Kappa值）。當(dāng)Kappa值在0.40～0.75認(rèn)為兩種診斷方式具有中度至高度一致性，Kappa＞0.75則兩種診斷方式一致性好。

2 結(jié)果

2.1 RIF病人宮腔鏡下的表現(xiàn)情況186例RIF病人宮腔鏡下診斷為CE的病人為112例（CE/HS組），呈正常宮腔鏡表現(xiàn)的病人74例（非CE/HS組），詳見圖1。

圖1 宮腔鏡下慢性子宮內(nèi)膜炎的表現(xiàn)：A為宮腔下子宮內(nèi)膜充血；B為宮腔鏡下子宮內(nèi)膜微小息肉；C為宮腔鏡下子宮內(nèi)膜血管增粗；D為宮腔鏡下子宮內(nèi)膜間質(zhì)水腫伴微小息肉

2.2 RIF病人子宮內(nèi)膜組織CD38、CD138表達(dá)情況186例RIF病人子宮內(nèi)膜組織中CD38呈陽性83例（44.62%），CD138呈陽性 79例（42.47%），CD38、CD138表達(dá)均呈陽性77例（41.40%，診斷為組織病理學(xué)CE），詳見表1。

表1 反復(fù)胚胎移植失敗病人子宮內(nèi)膜組織CD38、CD138的表達(dá)情況/例（%）

2.3宮腔鏡對CE的診斷參數(shù)宮腔鏡對CE診斷結(jié)果與組織病理學(xué)結(jié)果具有中度一致性（Kappa＝0.553），靈敏度為94.81%，特異度為64.22%，陽性預(yù)測值為65.18%，陰性預(yù)測值為94.60%，詳見表2。

表2 宮腔鏡對慢性子宮內(nèi)膜炎（CE）的診斷參數(shù)/例

3 討論

CE是指各種原因引起的子宮內(nèi)膜炎性改變，其確切病因尚不清楚，現(xiàn)階段普遍認(rèn)為是細(xì)菌、支原體、衣原體等感染引起的。雖然子宮內(nèi)膜周期性的剝落使感染的病原體排出體外，但是基底層內(nèi)膜無法周期性剝脫，一旦基底層內(nèi)膜組織發(fā)生長期感染，最終導(dǎo)致CE的發(fā)生。Kitaya等［11］對142例RIF病人行子宮內(nèi)膜活檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)33.7%的人患有CE，經(jīng)過有效的抗生素治療后，病人的臨床妊娠率明顯提高。Cicinelli等［8］同樣發(fā)現(xiàn)CE病人經(jīng)過抗生素治療后，病人的胚胎種植率、臨床妊娠率明顯提高，明顯改善其生殖預(yù)后。因此早期診斷、準(zhǔn)確診斷CE顯得尤其重要。

CE診斷金標(biāo)準(zhǔn)為在子宮間質(zhì)發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞，但是單核細(xì)胞浸潤、大量有絲分裂的基質(zhì)細(xì)胞、呈類漿細(xì)胞樣的基質(zhì)細(xì)胞、月經(jīng)后期以及活檢取材的局限性，使?jié){細(xì)胞的尋找尤為困難，較易造成誤診、漏診［7，12-13］。因此，尋找新的方法提高漿細(xì)胞的檢出率顯得尤為重要。在正常漿細(xì)胞中，免疫表型主要表現(xiàn)為CD38、CD138等，漿細(xì)胞較為特異的指標(biāo)為CD138，同時另有研究表明，漿細(xì)胞中的CD38分子具有較強(qiáng)的著色力。CD38是轉(zhuǎn)膜糖蛋白中的Ⅱ型，主要表達(dá)于漿細(xì)胞，但也表達(dá)在活化的T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞；CD138是由核心蛋白和未分枝的糖胺聚糖鏈共價結(jié)合形成的一類糖結(jié)合物，也是漿細(xì)胞特異性標(biāo)志物之一，表達(dá)于活化的β細(xì)胞、漿細(xì)胞以及胸腺細(xì)胞，大約95%石蠟切片的漿細(xì)胞表明均有CD138表達(dá)。因CD38、CD138不僅僅表達(dá)在漿細(xì)胞，在臨床實際工作中，采用免疫組化方法聯(lián)合檢測CD38、CD138提高對漿細(xì)胞的準(zhǔn)確識別，該方法對于CE的診斷優(yōu)于傳統(tǒng)HE染色法，并被學(xué)者廣為推薦［14-16］。

Johnston-MacAnanny等［10］獲取33例RIF病人的子宮內(nèi)膜組織，并使用CD138行免疫組化進(jìn)行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10例病人表達(dá)為陽性，陽性率為30.3%；另一研究顯示，同樣對RIF病人的子宮內(nèi)膜行CD138免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)33.7%（142/421）的病人表達(dá)為陽性，被診斷為CE［11］。Yang等［17］對202例RIF病人的子宮內(nèi)膜組織行CD38、CD138免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)43.6%的病人表達(dá)為陽性，診斷為子宮內(nèi)膜炎。本研究結(jié)果顯示，CD38細(xì)胞膜強(qiáng)陽性，CD138為漿細(xì)胞胞膜強(qiáng)陽性，胞質(zhì)弱陽性染色，在顯微鏡下相對于HE染色尋找漿細(xì)胞更容易，尤其在疑似CE病人標(biāo)本時，HE染色無法準(zhǔn)確辨認(rèn)漿細(xì)胞時，免疫組化染色可以有效顯示漿細(xì)胞，從而提高CE診斷的靈敏度和特異度。研究結(jié)果顯示，186例RIF病人中，77例CD38、CD138表達(dá)皆為陽性，診斷為CE，陽性率為41.40%。這與Johnston-MacAnanny等［10］、Yang等［17］團(tuán)隊的研究結(jié)果相似，顯示CD138主要表達(dá)于漿細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，CD38表達(dá)于細(xì)胞膜，大約有1/3的RIF病人患有CE。但國外研究中多采用CD138單一指標(biāo)行CE的診斷，容易造成假陽性的出現(xiàn)，聯(lián)合采用CD38，可提高診斷的特異度。

CD38、CD138免疫組化染色能夠很好地解決尋找漿細(xì)胞的問題，但在臨床工作中，取材受限也是造成漏診的重要原因。隨著微創(chuàng)器械技術(shù)的不斷發(fā)展，宮腔鏡已被廣泛應(yīng)用于宮腔狀況評估，具有檢查時間短，創(chuàng)傷較小的優(yōu)點，通過直觀觀察宮腔形態(tài)，明確病變部位，對可疑異常部位做出精確的活檢。子宮內(nèi)膜炎引起的子宮內(nèi)膜間質(zhì)、血管、腺體等多方面的改變，可以通過宮腔鏡檢測，宮腔鏡下子宮內(nèi)膜局灶或彌漫性充血、子宮內(nèi)膜微小息肉（＜1 mm）、子宮內(nèi)膜間質(zhì)水腫等對于CE的診斷具有重要作用［8-9，18-19］，但國內(nèi)對宮腔鏡下CE診斷的靈敏度及特異度性鮮有報道，其診斷CE臨床價值尚需進(jìn)一步證實。本研究中，186例病人均行宮腔鏡檢查，112例宮腔鏡下診斷為CE，余下74例宮腔鏡下未見明顯異常，在CE/HS組病人中，73例組織學(xué)診斷為CE，陽性率為65.18%，74例非CE/HS組病人中，4例診斷為CE，陽性率為5.41%，宮腔鏡在診斷CE與免疫組化病理學(xué)診斷結(jié)果具有中度一致性，靈敏度為94.81%，特異度為64.22%，陽性預(yù)測值為65.18%，陰性預(yù)測值為94.60%。結(jié)果提示，宮腔鏡檢查在CE的診斷具有一定的臨床意義，其靈敏度較高，特異度稍低，陰性預(yù)測值較高，不易漏診，但是其特異度、陽性預(yù)測值低，無法取代組織病理學(xué)診斷方法。因其靈敏度較高，同時可以全面評估宮腔以及子宮內(nèi)膜情況，對于RIF病人可行宮腔鏡檢查，評估子宮內(nèi)膜情況，對于可疑CE的部位進(jìn)行取材，聯(lián)合CD38、CD138進(jìn)行免疫組化診斷CE，在臨床工作中對于CE的診斷具有重要意義。

綜上所述，宮腔鏡診斷CE具有較高的靈敏度及陰性預(yù)測值，因其特異度低，無法替代組織病理學(xué)診斷方法，聯(lián)合CD38、CD138免疫組化染色能顯著提高CE的檢出率，具有重要的臨床意義。