徐東芳，王超，包訓(xùn)迪，王慶

作者單位：安徽省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 合肥230022

肺結(jié)核是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，是由結(jié)核分枝桿菌感染病人的肺部而引起的一種感染性疾?。?］。我國(guó)2007—2008年結(jié)核病耐藥基線調(diào)查結(jié)果顯示，肺結(jié)核病人耐多藥結(jié)核病（multidrugresistant tuberculosis，MDR-TB）率為8.32%，廣泛耐多藥（extensively drug-resistant tuberculosis，XDRTB）率為0.68%，估計(jì)全國(guó)每年大約新發(fā)MDR-TB病人14萬例［2］。我國(guó)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷能力普遍低，臨床上傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)——BACTECTMMGIT 960快速液體法（以下簡(jiǎn)稱為“MGIT 960法”）生物安全要求高，所耗時(shí)間長(zhǎng)，限制其在臨床中的應(yīng)用。近年來，隨著結(jié)核病耐藥分子機(jī)制研究逐步取得新進(jìn)展，人們建立了多種檢測(cè)耐藥結(jié)核病耐藥基因的快速分子診斷技術(shù)。線性探針技術(shù)（line probe assay，LiPA）通過檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因ropB以及異煙肼耐藥基因katG和inhA常見突變，可于6～8 h內(nèi)完成耐藥結(jié)核病檢測(cè)［3］。本研究旨在以MGIT 960法為標(biāo)準(zhǔn)，用LiPA檢測(cè)479例臨床疑似結(jié)核病病人痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）及相關(guān)耐藥基因rpoB、katG及inhA的突變，評(píng)價(jià)LiPA檢測(cè)效能及推測(cè)MTBC對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性，為耐藥結(jié)核病的早期診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料據(jù)《肺結(jié)核診斷和治療指南》［4］，連續(xù)納入2018年9月至12月安徽省胸科醫(yī)院結(jié)核科收治的479例結(jié)核病疑似病人的痰標(biāo)本。其中，男361例，女118例；年齡（48.07±12.52）歲，范圍為12～85歲。病人或其近親屬簽署知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2方法

1.2.1 主要儀器和試劑 BACTECTMMGIT 960全自動(dòng)快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定系統(tǒng)；分枝桿菌生長(zhǎng)指示管（mycobacterial growth indicator tube，MGIT）；分枝桿菌培養(yǎng)添加劑（主要包括：油酸、白蛋白、葡萄糖和過氧化氫酶）；分枝桿菌藥敏試劑盒系列（異煙肼、利福平一線抗結(jié)核藥物）均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；MPT 64抗原（杭州創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司）；GenoType MTBDRplus試劑盒（德國(guó)Hain Lifescience公司產(chǎn)品）。

1.2.2 方法 留取1～3 mL痰，4%氫氧化鈉消化前處理后，加入1 mL 0.067 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）混勻沉淀物，0.5 mL接種BD MIGT 960管（含0.8 mL營(yíng)養(yǎng)添加劑），0.5 mL用于LiPA檢測(cè)，對(duì)所有入選痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行MIGT 960培養(yǎng)和LiPA檢測(cè)。

1.2.2.1 MGIT 960法菌型鑒定和液體藥敏試驗(yàn)陽性培養(yǎng)物均做初步菌型鑒定，滴加3～4滴（約120μL）于MTBC分泌蛋白64（Mycobacterium tuberculosis secreting protein，MPT64）反應(yīng)板上進(jìn)行快速鑒定，鑒定為MTBC的菌株，嚴(yán)格按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)培訓(xùn)教程》［5］和BD MIGT 960說明書操作手冊(cè)將其加入含有利福平（1 mg/L）和異煙肼（0.1 mg/L）藥物的培養(yǎng)管中，進(jìn)行利福平和異煙肼的耐藥性檢測(cè)。

1.2.2.2 LiPA檢測(cè)方法 留取的0.5 mL臨床痰標(biāo)本前處理液于12 000 r/min離心5 min后棄上清，加入100μL無菌高純水中，充分混懸沉淀，95℃水浴20 min，超聲15 min后，5μL DNA提取液用于PCR過程，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，取20μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過化學(xué)變性、雜交孵育、洗滌、耦聯(lián)和顯色后，根據(jù)試紙條上的探針顯色結(jié)果判定樣本中是否含有MTBC及其對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性。

1.2.3 質(zhì)量控制 每次LiPA檢測(cè)均有陽性對(duì)照H37Rv和陰性對(duì)照（水）進(jìn)行質(zhì)控。LiPA檢測(cè)在雙盲下操作，野生條帶缺失且突變條帶未出現(xiàn)突變、野生或質(zhì)控條帶極弱甚至缺失，影響結(jié)果判讀的用陽性培養(yǎng)物重新進(jìn)行檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究均為計(jì)數(shù)資料，使用SPSS 22.0軟件，采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)（McNemar檢驗(yàn)）和Kappa一致性檢驗(yàn)以驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異與一致性。當(dāng)Kappa≥0.75時(shí)，一致性較好；0.40≤Kappa＜0.75時(shí)，一致性一般；Kappa＜0.40時(shí)，一致性較差。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTBC檢測(cè)效能的比較分析以MGIT 960法為標(biāo)準(zhǔn)，LiPA檢出MTBC的靈敏度和特異度分別為96.82%（274/283），97.45%（191/196），兩者檢測(cè)的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。且經(jīng)Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa＝0.940，P＜0.001，一致性較好。

表1 LiPA檢測(cè)479例結(jié)核病疑似病人的痰標(biāo)本結(jié)果分析/例

2.2 LiPA檢測(cè)利福平和異煙肼藥物敏感性的效能分析LiPA和MGIT 960法兩種方法檢測(cè)MTBC均陽性的標(biāo)本有274例，以MGIT 960法為標(biāo)準(zhǔn)，LiPA檢測(cè)利福平和異煙肼的靈敏度分別為95.18%（79/83）、81.61%（71/87），特異度分別為96.34%（184/191）、95.72%（179/187），兩者檢測(cè)的兩藥耐藥率均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。且經(jīng)Kappa一致性檢驗(yàn)，利福平、異煙肼耐藥Kappa＝0.906、0.793，均P＜0.001，一致性均較好。

2.3突變位點(diǎn)和基因突變類型LiPA檢測(cè)出的274株MTBC中，利福平耐藥86株，占31.387%（86/274），其中突變頻率最高的位點(diǎn)是S531L，占總耐藥的62.791%（54/86），其次是H526D，占15.116%（13/86），D516V占6.977%（6/86）。79株異煙肼耐藥株中，單獨(dú)katG基因突變占84.810%（67/79），inhA基因突變占7.595%（6/79），katG和inhA基因同時(shí)突變占7.595%（6/79），KatG基因常見突變位點(diǎn)是S315T，inhA基因常見突變位點(diǎn)是C15T。見表3。

表2 兩種方法進(jìn)行耐利福平、異煙肼藥物敏感性檢測(cè)特異度和靈敏度分析/例

表3 線性探針技術(shù)（LiPA）檢測(cè)出的274株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTBC）耐藥基因rpoB、katG和inhA突變譜的分布情況

3 討論

據(jù)WHO《2018年全球結(jié)核病報(bào)告》，2017年全球共有1 000萬例新發(fā)結(jié)核病例，其中耐藥結(jié)核病有56萬例，耐藥結(jié)核病中MDR-TB約占82%。加強(qiáng)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室能力建設(shè)，提升MDR-TB的檢測(cè)能力能夠加大病人的發(fā)現(xiàn)力度，更為有效地實(shí)施MDRTB控制策略。LiPA主要檢測(cè)利福平和異煙肼的3個(gè)主要耐藥基因（rpoB、katG和inhA）。

本研究以MGIT 960培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，LiPA檢測(cè)MTBC有較高的靈敏度和特異度，分別為96.82%、97.45%，能為臨床疑似肺結(jié)核病人的快速分子診斷提供新的可靠的檢測(cè)方法，且將報(bào)告時(shí)間縮短至1 d，說明LiPA的檢測(cè)效能大大提高［6-7］。本研究發(fā)現(xiàn)有9例病例LiPA陰性而MGIT 960培養(yǎng)陽性，用其陽性培養(yǎng)物重新進(jìn)行LiPA檢測(cè)，均能得出陽性結(jié)果?？紤]可能原因是（1）LiPA檢測(cè)過程中，痰標(biāo)本中存在Taq酶的抑制物抑制擴(kuò)增反應(yīng)；（2）痰標(biāo)本前消化處理過程中氫氧化鈉消化過度引起MTBC損傷或丟失，造成DNA提取量不足，呈陰性結(jié)果，其陽性培養(yǎng)物含菌量高，DNA提取量充足，受抑制物影響小，可以得到理想的條帶結(jié)果。另外5例MGIT 960法培養(yǎng)陰性的病例而LiPA檢測(cè)是陽性，我們查其病歷發(fā)現(xiàn)他們均為進(jìn)行抗結(jié)核治療有一段時(shí)間的結(jié)核病病人，可能痰標(biāo)本中只有極少一部分死菌或者細(xì)胞壁已經(jīng)破壞的L型菌，故不能再在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但其結(jié)核分枝桿菌的DNA還沒能完全降解，因此雖然培養(yǎng)陰性，但是LiPA可以檢測(cè)出陽性結(jié)果。

LiPA可以高效檢測(cè)MTBC對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性，本研究以MGIT 960法為標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)MTBC對(duì)利福平耐藥?kù)`敏度為95.18%（79/83），對(duì)異煙肼耐藥?kù)`敏度為81.61%（71/87），造成對(duì)異煙肼耐藥?kù)`敏度較低的可能原因是LiPA只能檢測(cè)其KatG和inhA基因，耐藥相關(guān)性只能達(dá)到70%～85%［8］，不能覆蓋異煙肼的全部耐藥基因，但是對(duì)其檢測(cè)的特異度均超過95%，因此LiPA檢測(cè)異煙肼耐藥性靶基因還需要進(jìn)一步研究。LiPA檢測(cè)利福平耐藥中突變頻率最高的是S531L，占62.791%（54/86）、其次是H526D（15.116%）和D516V（6.977%）。在異煙肼耐藥株中，katG基因突變占84.810%，inhA基因突變7.595%（6/79），katG和inhA基因同時(shí)突變7.595%（6/79），KatG基因常見的突變是S315T，inhA基因常見突變位點(diǎn)是C15T。有的菌株單純基因突變（ropBM3，inhA-M1），也有的基因突變同時(shí)伴有野生型基因的丟失（ropB-WT8-M3，inhA-WT1-M1）導(dǎo)致耐藥，不同地區(qū)或者同一地區(qū)不同時(shí)間段的結(jié)核分枝桿菌耐藥株的基因突變類型和頻率可能會(huì)因?yàn)槭苷{(diào)查人群數(shù)量的范圍而略有不同，這與國(guó)內(nèi)外的研究［9-10］基本相似。

綜上所述，以MGIT 960法為標(biāo)準(zhǔn)，LiPA診斷耐藥結(jié)核病具有靈敏度高、特異度強(qiáng)、快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為耐藥結(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供了診斷依據(jù)。但LiPA操作技術(shù)和防污染措施要求非常嚴(yán)格，必須在國(guó)家驗(yàn)收合格的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室才能開展工作。