鄧明，謝萍，馬永剛，周炎，賀斌，陳慶，吳飛，陳忠輝，明江華

作者單位：1武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨科，湖北 武漢430060；2武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科，湖北 武漢430060

脊髓損傷是臨床上常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，多由高能量損傷引起，比如車禍傷，高處墜落傷等［1-2］。脊髓損傷具有較高的致殘率，是臨床上的治療難點(diǎn)，雖然治療方式很多，但是效果一直不理想［3］。因此，尋找一種安全有效的治療方案是十分必要的。神經(jīng)干細(xì)胞可以從小鼠的紋狀體和脊髓中獲得，因其多分化潛能一直備受人們的關(guān)注［4-5］。也有學(xué)者將神經(jīng)干細(xì)胞直接注射入小鼠脊髓損傷模型中，但是修復(fù)效果不理想，原因可能有二，第一，神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量較少，增殖能力較弱；第二就是分化能力差，神經(jīng)干細(xì)胞分化的神經(jīng)元細(xì)胞功能較差，不能滿足需要［6-7］。所以尋找一種促神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的方案是臨床需求所在。

酪氨酸激酶受體A（Tyrosine kinase receptor A，Trk A）與神經(jīng)元細(xì)胞的存活和分化密切相關(guān)［8］，在海馬、新皮質(zhì)等部分均可以檢測到Trk A的表達(dá)，而且含量較高［9-10］。也有研究證明，Trk A與大腦的記憶功能密切相關(guān)［11］。因此，本研究于2018年1月至2019年1月通過siRNA技術(shù)構(gòu)建Trk A的過表達(dá)載體，通過慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，觀察其對神經(jīng)干細(xì)胞促增殖和分化作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基和Hank’s液均購于美國Gibco公司；胎牛血清（FBS）購于以色列BI公司；兔抗鼠Brdu及Nestin單克隆抗體購于Abcam公司；慢病毒的提取和Trk A的過表達(dá)載體的構(gòu)建由上海吉?jiǎng)P公司提供；MTT試劑盒購于Trizol提取試劑盒，Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Takara熒光定量PCR試劑盒購于日本Takara公司；AV-PI試劑盒購于聯(lián)科生物有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 神經(jīng)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng) 取新生SD雌性大鼠10只，體質(zhì)量（23.0±3.2）g，月齡為（4.4±0.8）月，符合SPF清潔級動(dòng)物指標(biāo)，動(dòng)物合格證號(hào)：2009A047，購于濟(jì)南動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，許可證號(hào)：SCXK魯20190001。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。常規(guī)消毒后，采用斷頸法處死SD大鼠，眼科剪分離SD大鼠腦組織，取海馬組織，Hank’s液清洗3遍，研磨棒研磨均勻，加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS溶液），制備細(xì)胞懸液，4℃低溫高速離心機(jī)16 000 r/min離心5 min，取沉淀物，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，制備細(xì)胞懸液，接種于25 mL的無菌培養(yǎng)瓶中。置入37℃、體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳下培養(yǎng)，3 d換液1次，待細(xì)胞融合率達(dá)80%以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定 本研究采用免疫熒光的方法對神經(jīng)球進(jìn)行鑒定，取第3代神經(jīng)干細(xì)胞，胰蛋白酶消化后加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，對胰蛋白對進(jìn)行拮抗，普通離心機(jī)5 000 r/min離心5 min，取沉淀物，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，制備細(xì)胞懸液，接種于24孔玻璃板中，待細(xì)胞融合率為50%左右時(shí)，去掉培養(yǎng)基，PBS溶液清洗3遍，加入5%甲醛溶液固定20 min，PBS溶液清洗3遍，加入20%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）進(jìn)行透膜處理，PBS溶液清洗3遍，加入兔抗鼠Brdu及Nestin單克隆抗體，避光4℃過夜處理（＞12h），PBS溶液清洗3遍，加入含CY3（紅色）和GFP（綠色）熒光二抗，避光孵育30 min，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 Trk A的過表達(dá)載體的構(gòu)建 Trk A的過表達(dá)載體的構(gòu)建和篩選由上海吉?jiǎng)P公司完成。首先對目的基因進(jìn)行過表達(dá)引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)序列為：TrkA（4589-11）：P1：ACGGGACTAAGCGCATTGCAATTTCC；Trk A（4589-11）：P2：GAATCGCGTTGCATGCCGTAA。然后RT-PCR擴(kuò)增目的基因序列，將目的基因擴(kuò)增序列加入線性化表達(dá)載體，選取上海吉?jiǎng)P公司提供的hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒載體作為酶切對象，加入Trk A基因過表達(dá)載體序列后，轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，進(jìn)行克隆測定，然后進(jìn)行質(zhì)粒的抽提，慢病毒的包裝以備用。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 將神經(jīng)干細(xì)胞分成三組，即空白對照組，陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組?？瞻讓φ战M為未做任何處理的細(xì)胞組，陰性對照組是經(jīng)空白載體的慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組，實(shí)驗(yàn)組是由Trk A的過表達(dá)載體構(gòu)建的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測Trk A和神經(jīng)分化基因Tuj1、GFAP、CNPase的表達(dá) 利用胰蛋白酶收集上述各組細(xì)胞（空白對照組，陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組），經(jīng)PBS溶液清洗3次，常溫離心機(jī)1 500 r/min離心5 min，取沉淀，加入1 mL Trizol溶劑，提取細(xì)胞總RNA，保證RNA純度范圍為1.8～2.1，然后利用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求，采用20μL反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），-80℃保存，采用Takara熒光定量PCR試劑盒（SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒）的要求，采用FTC-2000 RT-PCR系統(tǒng)和50μg反應(yīng)體系對樣本DNA進(jìn)行分析，溶解曲線確定Tm值為53.7℃，統(tǒng)計(jì)并記錄各組樣本的CT值，采用2-△△CT法對 Trk A 和神經(jīng)分化基因 Tuj1，GFAP 和CNPase的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。Trk A，Tuj1，GFAP，CNPase和內(nèi)參基因GAPDH引物設(shè)計(jì)由上海生工公司設(shè)計(jì)并檢測合格（表1）。

表1 酪氨酸激酶受體A（Trk A）、神經(jīng)分化基因Tuj1、GFAP、CNPase和內(nèi)參基因GAPDH引物序列

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測Trk A，Tuj1，GFAP和CNPase的蛋白表達(dá) 慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后，收集上述三組細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)基后，PBS清洗后，加入2 mL RIPA細(xì)胞裂解液，冰上孵育45 min，細(xì)胞刮收集細(xì)胞碎片，加入PE管中，預(yù)冷高速離心機(jī)，4℃，12 000 r/min，收集總蛋白，加入10μL苯甲基磺酰氟（PMSF），99℃煮沸，BAD試劑盒測定蛋白的分子量。按照說明書，配置10%分離膠和4%濃縮膠，加入50 ng蛋白量，1×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液浸沒膠板，40 V電泳2 h后轉(zhuǎn)染到硝酸纖維素膜，等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜后，過夜孵育Trk A、Tuj1、GFAP和CNPase的蛋白一抗，TBST液洗膜，常溫孵育鼠抗山羊辣根過氧化物酶（HRP）二抗30 min，DAB顯影，Image J軟件分析蛋白條帶。

1.2.7 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖 利用胰蛋白酶收集上述各組細(xì)胞（空白對照組，陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組），經(jīng)PBS溶液清洗3次，常溫離心機(jī)1 500 r/min離心5 min，取沉淀，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基5 mL，制成細(xì)胞懸液。接種在96孔板中，以每孔5 000個(gè)/100微升的接種量接種，按照CCK-8試劑盒的說明書，72 h后每孔加入10μL的CCK-8的試劑，放到37℃，5%二氧化碳濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀，在450 nm波長處測定吸光度，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用形式表示。三組比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定結(jié)果懸浮培養(yǎng)細(xì)胞5 d后，形成神經(jīng)細(xì)胞球；免疫熒光染色顯示神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞球Nestin（紅色熒光），Brud染色（綠色熒光）陽性，且占細(xì)胞量的90%以上；熒光雙標(biāo)染色（棕色熒光）顯示雙染細(xì)胞量占總細(xì)胞量的90%以上，說明培養(yǎng)的細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞。見圖1。

2.2 Trk A過表達(dá)載體的構(gòu)建和慢病毒轉(zhuǎn)染以綠色熒光蛋白（GFP）為熒光探針，完成Trk A過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建。慢病毒轉(zhuǎn)染效率較高，以人胚腎293T細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，慢病毒轉(zhuǎn)染率如圖2所示。慢病毒滴度的檢測結(jié)果：Trk A過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染滴度為3×108TU/mL。

2.3 RT-PCR檢測Trk A與神經(jīng)干細(xì)胞分化標(biāo)志分子的mRNA表達(dá)空白對照組和陰性對照組的Trk A與神經(jīng)分化標(biāo)志分子Tuj1、GFAP和CNPase的mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而實(shí)驗(yàn)組的Trk A與神經(jīng)分化標(biāo)志分子的mRNA相對表達(dá)量要明顯高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測酪氨酸激酶受體A（Trk A）與神經(jīng)干細(xì)胞分化標(biāo)志分子的mRNA表達(dá)/

表2 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測酪氨酸激酶受體A（Trk A）與神經(jīng)干細(xì)胞分化標(biāo)志分子的mRNA表達(dá)/

注：與空白對照組比較，aP＞0.05；與空白對照組比較，bP＜0.05；與陰性對照組比較，cP＜0.05

CNPase 1.27±0.05 1.12±0.07a 4.69±0.76bc 9.98 0.012組別空白對照組陰性對照組實(shí)驗(yàn)組F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 Trk A 1.09±0.09 1.11±0.05a 7.12±1.32bc 10.91 0.009 Tuj1 1.12±0.04 1.19±0.06a 3.26±0.98bc 14.23＜0.001 GFAP 1.15±0.07 1.11±0.05a 10.34±2.56bc 18.45＜0.001

2.4蛋白質(zhì)印跡法檢測Trk A與神經(jīng)干細(xì)胞分化標(biāo)志分子的蛋白表達(dá)空白對照組和陰性對照組Trk A以及神經(jīng)分化標(biāo)志分子Tuj1，GFAP和CNPase的蛋白表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組Trk A以及神經(jīng)分化標(biāo)志分子的蛋白表達(dá)量要明顯高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）。見圖3、表3。

2.5神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力比較結(jié)果CCK-8試劑盒檢測結(jié)果表明，空白對照組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率分別為（87.92±9.21）%、（88.22±9.37）%、（176.01±11.33）%（F＝18.45，P＝0.001），其中空白對照組和陰性對照組的細(xì)胞增殖率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率要明顯高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）。

表3 蛋白質(zhì)印跡法檢測酪氨酸激酶受體A（Trk A）與神經(jīng)干細(xì)胞分化標(biāo)志分子的蛋白相對表達(dá)量/

表3 蛋白質(zhì)印跡法檢測酪氨酸激酶受體A（Trk A）與神經(jīng)干細(xì)胞分化標(biāo)志分子的蛋白相對表達(dá)量/

注：與空白對照組比較，aP＞0.05；與空白對照組比較，bP＜0.05；與陰性對照組比較，cP＜0.05

CNPase 147.29±37.87 155.45±29.86a 398.14±30.55bc 37.12＜0.001組別空白對照組陰性對照組實(shí)驗(yàn)組F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 Trk A 121.12±22.45 128.19±21.33a 476.18±19.32bc 20.76＜0.001 Tuj1 67.12±9.13 70.13±9.08a 95.14±6.22bc 29.78＜0.001 GFAP 109.18±34.09 111.17±38.21a 698.39±20.22bc 30.27＜0.001

3 討論

在本研究中，主要著眼于神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化研究，利用siRNA技術(shù)構(gòu)建Trk A的過表達(dá)載體，利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，觀察其對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化作用，此為本研究的創(chuàng)新點(diǎn)。

神經(jīng)干細(xì)胞治療脊髓損傷是非常有前景的治療方案，相較于手術(shù)和藥物治療，具有明顯的優(yōu)勢。神經(jīng)干細(xì)胞對于脊髓損傷的修復(fù)具有十分重要的作用［12］。但是神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力弱［13］，分化能力差［14］，單純的神經(jīng)干細(xì)胞移植對于脊髓損傷的修復(fù)作用并不理想。神經(jīng)干細(xì)胞治療脊髓損傷利用神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞原位增殖和分化，根據(jù)損傷部位的功能需求和周圍內(nèi)環(huán)境的要求，神經(jīng)干細(xì)胞可以定向分化為神經(jīng)元細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等，從而更好地對脊髓功能進(jìn)行修復(fù)［15-16］。本研究以神經(jīng)干細(xì)胞為研究對象，通過取新生SD大鼠的海馬組織，提取和培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，以Nestin和Brud染色［17-18］對神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果證明我們提取的是神經(jīng)干細(xì)胞。然后我們進(jìn)一步尋找新的方法促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。

Trk A與神經(jīng)元細(xì)胞的存活和分化密切相關(guān)，在海馬、新皮質(zhì)等部分均可以檢測到Trk A的表達(dá)，而且含量較高［19］。幾乎所有的膽堿能神經(jīng)元都含有Trk A，所以Trk A在膽堿能神經(jīng)元的分化和成熟過程中起到一定的作用［20］。也有研究證明Trk A與神經(jīng)生長因子（NGF）相結(jié)合，共同促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞的再生和干細(xì)胞的分化［21］?？梢奣rk A的表達(dá)量增多可以促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的增殖和分化。既往文獻(xiàn)表明，Tuj1蛋白是神經(jīng)元細(xì)胞的標(biāo)志物，GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，CNPase是少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物［22-23］。本研究利用siRNA技術(shù)，構(gòu)建Trk A的過表達(dá)載體，通過慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，目的是通過促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)Trk A的過表達(dá)，觀察其生物學(xué)行為，結(jié)果證明，Trk A的過表達(dá)載體不僅可以促進(jìn)Trk A mRNA水平的表達(dá)，還可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化標(biāo)志分子Tuj1，GFAP和CNPase的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。另外，本研究也通過CCK-8試劑盒檢測了神經(jīng)元干細(xì)胞的增殖，結(jié)果表明，Trk A的過表達(dá)載體也可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，從而解決了神經(jīng)元干細(xì)胞的增殖能力低下的問題，為神經(jīng)元干細(xì)胞用于脊髓損傷的治療提供了更多的依據(jù)和方案。

然而本研究尚有不足，Trk A過表達(dá)載體可以促進(jìn)神經(jīng)元干細(xì)胞的分化和增殖，但涉及的信號(hào)通路機(jī)制尚不明確，這也是本研究以后將要進(jìn)行的工作。

綜上所述，Trk A過表達(dá)載體可以促進(jìn)神經(jīng)元干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞，星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化，并且可以促進(jìn)神經(jīng)元干細(xì)胞的增殖。

（本文圖1～3見插圖12-3）