任瑩，呂曉軍，李德林，王虎

作者單位：太和縣中醫(yī)院制劑室，安徽 阜陽236600

保肝丸是太和縣中醫(yī)院國家級重點科室肝病科臨床應(yīng)用多年的專用方，主要由黨參、白芍、大黃等中藥組成。保肝丸作為療效顯著且臨床應(yīng)用多年的醫(yī)院傳統(tǒng)中藥制劑，亟須建立完善的質(zhì)量控制及評價方法，為該制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究于2018年6—12月以對照品便宜易得的黃芩苷為內(nèi)標，建立保肝丸中主要藥味的指標性成分芍藥苷、五味子醇甲、大黃素含量的QAMS，以期為保肝丸的質(zhì)量控制提供更全面可靠的依據(jù)，進而保證制劑質(zhì)量，確保臨床療效。

1 儀器與試劑

UltiMate3000高效液相色譜儀［二極管陣列檢測器（DAD），賽默飛世爾科技有限公司］；Agilent1220型高效液相色譜儀（紫外檢測器，安捷倫科技有限公司）；XP205DR型十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DE超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司），萬能粉碎機（上海賀帆儀器有限公司）。

對照品黃芩苷（110715-201720），芍藥苷（110736-201640），五味子醇甲（110857-201714），大黃素（110756-201512）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇，均為色譜純，美國天地公司；磷酸，分析純，天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；哇哈哈純凈水。

保肝丸為太和縣中醫(yī)院中藥制劑室生產(chǎn)，批號分別為 20170826、20171012、20171221、20180127、20180306、20180509。缺味陰性樣品均由中藥制劑室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別取芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為0.683 1、0.442 1、0.374 5、0.368 1 g/L的對照品儲備液。分別精密吸取芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇定容制成6個質(zhì)量濃度不同的混合對照品溶液，分別編號1、2、3、4、5、6。

2.1.2 供試品溶液的制備 取保肝丸適量，粉碎，過四號篩，精密稱取約1 g，加甲醇25 mL，稱重，超聲處理30 min，放冷，稱重，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

現(xiàn)在司乘人員只需用手機掃描二維碼，即可完成路政賠補償款支付，這不僅有效解決了司乘人員因現(xiàn)金零錢不足而不能支付的燃眉之急。同時也減少了基層工作人員辨別真?zhèn)魏椭脫Q零錢的工作量。節(jié)省了雙方時間，也大大提高了工作效率和工作質(zhì)量。

2.1.3 保肝丸缺白芍溶液的制備 按保肝丸的制備工藝制得缺白芍的陰性樣品，按“2.1.2”項下的制備方法制備缺白芍陰性供試液。

2.1.4 保肝丸缺黃芩溶液的制備 按保肝丸的制備工藝制得缺黃芩的陰性樣品，按“2.1.2”項下的制備方法制備缺黃芩陰性供試液。

2.1.5 保肝丸缺五味子溶液的制備 按保肝丸的制備工藝制得缺五味子的陰性樣品，按“2.1.2”項下的制備方法制備缺五味子陰性供試液。

2.1.6 保肝丸缺大黃溶液的制備 按保肝丸的制備工藝制得缺大黃的陰性樣品，按“2.1.2”項下的制備方法制備缺大黃陰性供試液。

2.2色譜條件UltiMate3000高效液相色譜儀，依利特Hypersil ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），以乙腈和0.01%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，梯度洗脫時間及比例見表1，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，分段變波長測定0～25 min，230 nm、＞25～50 min，280 nm，＞50～90 min，254 nm。

表1 UltiMate3000高效液相色譜儀梯度洗脫時間表

2.3方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 按“2.2”色譜條件，分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、各缺味陰性對照溶液，依次注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，各陰性對照均無干擾（圖1），說明該方法專屬性較好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.1”項下系列混合對照品溶液各5μL，注入高效液相色譜儀。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得各成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)，具體見表2。

表2 混合對照品溶液4種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.3 精密度試驗 取保肝丸樣品（批號20180127），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素的峰面積，計算各成分峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為0.34%、0.62%、0.21%、0.22%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取保肝丸樣品（批號20180127），按照“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，分別進樣，記錄各色譜峰的峰面積。計算結(jié)果顯示芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素的平均含量分別為1.708、1.106、0.935、0.921 mg/g，RSD分別為1.02%、0.87%、1.16%、0.68%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取保肝丸樣品（批號20180127），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于樣品制備后0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄各色譜峰的峰面積。計算得芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素峰面積的RSD分別為0.65%、0.79%、1.04%、0.92%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗 取保肝丸樣品（批號20180127）6份，每份約0.5 g，精密稱定，加入一定量對照品溶液，使樣品中待測成分量與對照品加入量大致相等，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣并記錄各色譜峰的峰面積。計算得芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素的平均加樣回收率分別為98.65%、101.23%、99.32%、97.58%，RSD分別為1.26%、1.04%、1.35%、1.13%。表明該方法準確度較高。

2.4相對校正因子的確定

2.4.1 相對校正因子的測定 本實驗采用多點校正法［1］，取“2.1.1”項下制備的系列混合對照品溶液，按照“2.2”項下色譜條件分別進樣5μL，記錄各對照品色譜峰面積，按照公式fk/m＝fk/fm＝（Wk×Am）/（Wm×Ak）（式中Ak為內(nèi)參物的峰面積，Wk為內(nèi)參物的質(zhì)量或濃度；Am為待測物的峰面積，Am為待測物的質(zhì)量或濃度），以黃芩苷為內(nèi)參物，分別計算芍藥苷、五味子醇甲、大黃素的相對校正因子［9］，結(jié)果見表3。

表3 指標性成分的相對校正因子

2.4.2 不同儀器和色譜柱對校正因子的影響 分別采用賽默飛UltiMate3000、Agilent1220型高效液相色譜儀；依次利用依利特Hypersil ODS2、Thermo Syncrois C18、Agilent ZORBAX SB C18色譜柱，取系列對照品進樣檢測，按照“2.4.1”項下公式，計算各成分的相對校正因子，考察不同色譜儀器和色譜柱對各待測成分的相對校正因子的影響，結(jié)果見表4，5。結(jié)果表明不同儀器和不同色譜柱對各成分的相對校正因子無明顯影響。

表4 不同儀器對相對校正因子的影響

表5 不同色譜柱對相對校正因子的影響

2.5樣品測定及準確性驗證分別采用外標法和一測多評法（QAMS）測定6批保肝丸中4種指標性成分芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素的含量，并將兩種方法的計算結(jié)果進行比較，結(jié)果表明外標法和本實驗建立的一測多評法所得結(jié)果無明顯差異，各待測成分的相對校正因子可靠，該一測多評法準確度較高。見表6。

3 討論

中藥具有多成分、多靶點的作用特點，中藥的多種活性成分是其發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此多成分的質(zhì)控模式已成為中藥質(zhì)量控制的重點［10-12］。本實驗測定的4種成分芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素是處方中主要指標性成分。研究表明黃芩苷能改善炎癥及肝細胞凋亡，減輕肝細胞損傷程度，且效果與黃芩苷用量相關(guān)［13］，另有動物實驗表明黃芩苷對肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展具有抑制作用［14］；芍藥苷能抑制肝損傷中炎性因子的產(chǎn)生，提高肝組織中膽鹽輸出泵（BSEP）和多藥耐藥蛋白（MRP2）的表達［15-16］；五味子醇甲能抗氧化、對肝損傷具有保護作用［17］；大黃素能降低肝細胞炎癥反應(yīng)，減少肝細胞凋亡，進而減輕肝細胞損傷程度［18］，對膽汁淤積引起的肝損傷具有保護作用［19］。

本實驗測定的4種指標性成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)差異較大，為能夠同時分離檢測4種成分，對各實驗條件及參數(shù)進行了反復(fù)摸索。首先采用單因素變量法考察了提取條件，包括提取溶劑、提取方式、提取時間，優(yōu)選出25倍甲醇超聲處理30 min。其次，流動相方面選擇洗脫能力較強的乙腈和0.1%磷酸水溶液，各個目標峰均能達到較好的分離度且峰型較好。最后檢測波長考察，根據(jù)4種成分的紫外全波長掃描結(jié)果，選擇分段檢測，即230 nm檢測芍藥苷，280 nm檢測黃芩苷，254 nm檢測五味子醇甲和大黃素。

該實驗利用梯度洗脫的方法使4種成分均能達到較高的分離度，并通過專屬性實驗證明各成分的含量測定均無干擾；選擇DAD檢測器進行分波段檢測，雖然化學(xué)結(jié)構(gòu)差異較大，各成分仍能有較高的信號相應(yīng)，精密度較高；同時線性關(guān)系考察結(jié)果顯示在一定范圍內(nèi)各成分的峰面積與進樣量呈良好線性關(guān)系；加樣回收實驗的結(jié)果顯示含量測定的準確度較高。以上試驗作為該方法的前期方法學(xué)考察，顯示了該方法在分離檢測上的準確性和可靠性，為下一步的數(shù)學(xué)模式分析奠定基礎(chǔ)。QAMS是以一種組分為內(nèi)參，通過建立其與其他待測成分的相對校正因子，實現(xiàn)以一種對照品同時測定多個指標成分的目的。故相對校正因子是影響QAMS的準確度的決定性因素，而實際運用中，待測組分的濃度及色譜系統(tǒng)因素均會對相對校正因子產(chǎn)生影響。實驗在充分考慮濃度因素的情況下，運用多點校正法［1］計算相對校正因子；并進一步重點考察了不同色譜儀、不同色譜柱的相對校正因子，結(jié)果顯示RSD均小于2%，表明該方法的系統(tǒng)適應(yīng)性較好。最后，通過比較外標法和QAMS的測定結(jié)果，兩種方法無明顯差異，說明各待測成分的相對校正因子可靠，該QAMS準確度較高。

表64 種指標性成分外標法和一測多評法（QAMS）定量測定結(jié)果/（mg/g）

綜上，本實驗建立了以黃芩苷為對照品，同時測定保肝丸中芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素4種指標性成分的方法，與常規(guī)的一測一評法比較大大降低了質(zhì)控的成本，縮短了檢測周期，經(jīng)驗證該方法專屬性強、重復(fù)性好，準確度高，為保肝丸的全面質(zhì)量控制提供了更為便捷經(jīng)濟的途徑。