王春亞，馬琪，張娜，裴斐

作者單位：西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，a心血管外科，b重癥醫(yī)學(xué)科，c病理科，陜西 西安710004

急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床常見(jiàn)急危重癥之一，多繼發(fā)于嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷等疾病過(guò)程中，其主要發(fā)病機(jī)制為各種病因繼發(fā)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮細(xì)胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，引起急性呼吸功能障礙［1］。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的不斷進(jìn)展，細(xì)胞凋亡在ARDS的發(fā)病過(guò)程中所起的作用日益受到重視，故干預(yù)細(xì)胞凋亡可能是治療ARDS的新手段和方式，值得更進(jìn)一步深入探討。脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）是一種由脂肪細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)激素，具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、增加胰島素敏感性等多種生物效應(yīng)。以往的研究發(fā)現(xiàn)APN可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗炎作用，達(dá)到肺保護(hù)作用。但APN是否通過(guò)改變ARDS的細(xì)胞凋亡來(lái)影響病情發(fā)展，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本課題于2018年1—12月擬針對(duì)這一方面展開(kāi)深入研究。

1 材料與方法

1.1材料雄性Wistar大鼠45只，體質(zhì)量范圍為150～200 g，周齡范圍為6～7周，購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（陜）2014-002。鼠基因重組APN購(gòu)于Biovision公司（CA.USA）；細(xì)菌內(nèi)毒素（Lipopolysaccharide，LPS）購(gòu)于美國(guó)Sigema公司；檢測(cè)腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor a，TNF-α）和白細(xì)胞介素-10（Interleukin 10，IL-10）的Elisa試劑盒及檢測(cè)凋亡因子的蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）試劑盒均購(gòu)于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.2方法選用同種同窩Wistar雄性大鼠45只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，分別為對(duì)照組、LPS組和APN組。制備模型前禁食不禁水12 h，LPS組：經(jīng)腹腔注射LPS 7.5 mg/kg，APN組：造模前12 h經(jīng)腹腔注射鼠重組 APN 6 mg/kg［2］，對(duì)照組：經(jīng)腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.3標(biāo)本采集與指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 血標(biāo)本采集 造模12 h后，用10%水合氯醛0.35 mL/100 g對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，用器械分離組織，暴露心臟，用5 mL注射器穿刺采血5 mL，緩慢注入含有10%乙二胺四乙酸（EDTA）的干燥試管中，立即搖勻，2 000 r/min，離心20 min，取上清液置于-80℃超低溫冰箱凍存待測(cè)。

1.3.2 肺組織的采集 游離出左下肺，取部分肺組織，經(jīng)甲醛固定后，脫水、石蠟包埋切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺組織病理學(xué)變化；剩余左肺下葉組織標(biāo)本用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次，按照1 mL/100 mg的比例將肺組織加入PBS中，使用電動(dòng)勻漿機(jī)制成勻漿，以4℃，12 000 r/min離心后取上清，置于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 血漿和肺組織中 TNF-α、IL-10的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)各組大鼠造模后12 h血漿中TNF-α、IL-10，其方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。

1.3.4 肺組織中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白相對(duì)含量測(cè)定 采用蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定。提取肺組織中總蛋白質(zhì)，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，BCA法測(cè)定蛋白濃度，常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入Bax、Bcl-2、Caspase-3抗體或β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體4℃輕搖過(guò)夜，洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶抗體標(biāo)記二抗，化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)X線壓片曝光，將膠片進(jìn)行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。以Bax、Bcl-2、Caspase-3或 β-actin條帶的吸光面積積分比值來(lái)評(píng)定蛋白表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，連續(xù)變量（非正態(tài)分布資料）采用中位數(shù)（下、上四分位數(shù)）［M（P25，P75）］進(jìn)行描述，多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，對(duì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的指標(biāo)進(jìn)一步進(jìn)行多組間兩兩比較，以P＜0.016 7為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1三組大鼠血漿中TNF-α、IL-10水平比較APN組和LPS組的TNF-α及IL-10水平均高于對(duì)照組，而低于LPS組（P＜0.016 7）。見(jiàn)表1。

2.2三組大鼠肺組織中TNF-α、IL-10水平比較APN組和LPS組的TNF-α及IL-10水平均高于對(duì)照組，而低于LPS組（P＜0.016 7）。見(jiàn)表2。

2.3各組大鼠肺組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較LPS組和APN組的三種蛋白水平均高于對(duì)照組（P＜0.016 7）；APN組的Bcl-2高于LPS組，Caspase-3低于LPS組（P＜0.016 7），而B(niǎo)ax水平兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.016 7）。見(jiàn)表3。

表3 三組大鼠肺組織中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白水平比較/M（P25，P75）

2.4三組大鼠肺組織病理改變光鏡下，對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡形態(tài)完整，肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰；LPS組肺泡組織結(jié)構(gòu)不清，間隔明顯增厚，間質(zhì)充血水腫明顯，肺泡腔內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)不同程度的塌陷及肺不張；APN干預(yù)組肺間質(zhì)充血、水腫程度較模型組減輕，肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見(jiàn)圖1。

3 討論

近年來(lái)，盡管ARDS的基礎(chǔ)研究及臨床診治取得長(zhǎng)足發(fā)展，但其病死率仍可高達(dá)35%～40%，值得密切關(guān)注［3］。目前關(guān)于ARDS的發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說(shuō)，其中最主要的為炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)，當(dāng)各種病因誘發(fā)失控性炎癥反應(yīng)時(shí)，會(huì)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞的通透性增加，繼而各種炎癥細(xì)胞及富含蛋白的水腫液，進(jìn)入肺泡腔及肺間質(zhì)，最終導(dǎo)致呼吸衰竭［4-5］。參與ARDS發(fā)病的炎性介質(zhì)中，影響最大的是TNF-α和白細(xì)胞介素。TNF-α是炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)中至關(guān)重要的始動(dòng)因子，主要由巨噬細(xì)胞分泌，可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬能力，并且上調(diào)ICAM-1的表達(dá)，激發(fā)中性粒細(xì)胞釋放更多炎性因子［6］。白介素包括促炎因子和抗炎因子，IL-10作為人體內(nèi)重要的抗炎因子，可抑制炎癥反應(yīng)，重建炎癥反應(yīng)和抗炎反應(yīng)的平衡。研究發(fā)現(xiàn)因ARDS死亡病人的疾病初期，其肺泡灌洗液中的IL-10水平較低，推測(cè)IL-10不足可能是導(dǎo)致促炎因子生成增多以及肺內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇的原因之一［7］。本研究采用LPS腹腔注射造模的肺組織病理切片提示與對(duì)照組相比，模型組肺組織的炎癥反應(yīng)明顯加重。進(jìn)一步將對(duì)照組和LPS組大鼠相關(guān)炎性指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是肺組織還是血漿中TNF-α和IL-10水平，LPS組均高于對(duì)照組，說(shuō)明促炎因子水平增加時(shí)，機(jī)體內(nèi)的抗炎因子水平也會(huì)相應(yīng)增加，來(lái)維持機(jī)體促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的平衡。

APN是一種具有抗炎效應(yīng)的細(xì)胞因子，可通過(guò)多種機(jī)制下調(diào)IL-6、TNF-α等促炎因子水平，上調(diào)抗炎因子水平［8-9］，并能直接與細(xì)菌脂多糖相結(jié)合來(lái)改善炎癥反應(yīng)，減輕靶器官損害程度。APN與ARDS發(fā)病有一定相關(guān)關(guān)系，Jason M Konter等［10］發(fā)現(xiàn)經(jīng)氣道滴入脂多糖，APN-/-組小鼠的肺損傷程度及炎癥反應(yīng)均重于對(duì)照組，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明外源性補(bǔ)充APN可減輕ARDS及炎癥反應(yīng)性疾病的嚴(yán)重程度，并改善預(yù)后［11］。本實(shí)驗(yàn)APN組在ARDS造模前12h經(jīng)腹腔注射APN，其病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APN干預(yù)的大鼠肺組織損傷程度相較于LPS組明顯減輕，且肺組織和血漿中TNF-α和IL-10水平均明顯低于LPS組，說(shuō)明減輕炎癥反應(yīng)是APN控制肺組織損傷的機(jī)制之一，這與之前的研究結(jié)果相似。

除了炎癥反應(yīng)機(jī)制，近年來(lái)細(xì)胞異常凋亡在ARDS的發(fā)病過(guò)程中所起的作用日益受到重視。目前認(rèn)為有三類細(xì)胞的凋亡與ARDS發(fā)病密切相關(guān)，包括多形核粒細(xì)胞（Polymorpho-nuclear leukocyte，PMN）、肺泡上皮細(xì)胞及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，其中最主要的是PMN細(xì)胞。該細(xì)胞是機(jī)體防御外來(lái)病原體的第一道防線，具有非特異性防御功能，在機(jī)體發(fā)生ADRS時(shí)，PMN被過(guò)度激活，并釋放大量炎性介質(zhì)、活性氧自由基、蛋白水解酶等，導(dǎo)致組織及器官的損傷，因此其適時(shí)凋亡對(duì)減輕組織損傷具有重要意義。但研究發(fā)現(xiàn)，ARDS早期，PMN凋亡延遲，同時(shí)伴有內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，凋亡通路的失衡可能在ARDS發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用［12］。目前研究較多的與ARDS相關(guān)的凋亡因子，包括抑凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax及Caspase-3［13］。Bcl-2是一種主要分布于核膜、線粒體外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的膜結(jié)合蛋白，可以通過(guò)多種途徑參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，是多種細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性因子，其高表達(dá)往往可以阻止正常細(xì)胞的凋亡程序的啟動(dòng)，從而延長(zhǎng)細(xì)胞壽命［14］。在ARDS急性期，Bcl-2呈現(xiàn)低表達(dá)，導(dǎo)致病情加重［15］。Bax定位于細(xì)胞質(zhì)，屬于Bcl-2家族成員之一，轉(zhuǎn)染Bax不僅能引起許多細(xì)胞自發(fā)凋亡，而且能夠促進(jìn)多種因素引起的多種細(xì)胞凋亡。Bax與Bcl-2具有一定同源性，可形成一對(duì)具有雙向調(diào)節(jié)作用的異型二聚體，其比例決定了細(xì)胞生存還是凋亡［16-17］。Guinee等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，在彌漫性肺泡損傷的病人中，其肺組織Bax蛋白的表達(dá)顯著性增高，提示Bax的高表達(dá)與急性肺損傷密切相關(guān)。Caspase-3是Caspase酶系家族中的重要一員，是凋亡通路的關(guān)鍵執(zhí)行者，可通過(guò)多個(gè)途徑來(lái)參與ARDS的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)在急性胰腺炎肺損傷中，Capase-3蛋白酶表達(dá)早期即可出現(xiàn)升高，表明急性肺損傷與Caspase-3蛋白表達(dá)升高有著密切關(guān)聯(lián)［18-19］。多種凋亡因子的共同作用決定著ARDS的發(fā)生發(fā)展。故此干預(yù)細(xì)胞凋亡可能是治療ARDS的新手段和方式。本研究將三組大鼠肺組織中的抑凋亡因子Bcl-2，和促凋亡因子Caspase-3及Bax進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)APN組的Bcl-2表達(dá)高于LPS組，而Caspase-3表達(dá)均低于LPS組，說(shuō)明APN通過(guò)對(duì)凋亡因子調(diào)控來(lái)達(dá)到肺保護(hù)作用。然而本實(shí)驗(yàn)僅發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，但APN具體是通過(guò)哪些途徑來(lái)調(diào)控凋亡因子的水平并不清楚，未來(lái)擬通過(guò)進(jìn)一步研究來(lái)闡明其中的機(jī)制。

綜上所述，APN不僅通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)降低ARDS大鼠的肺部損傷程度，還可能通過(guò)影響組織細(xì)胞凋亡來(lái)達(dá)到肺保護(hù)作用。

（本文圖1見(jiàn)插圖12-1）