張星明，顧文莉

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200011）

口腔癌是較常見的頭頸部惡性腫瘤之一，每年全世界有新發(fā)患者52.9萬例，其中我國占8.7%，并呈現(xiàn)逐年增多的趨勢[1]?？谇击[狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是口腔癌最主要的病理學(xué)類型，占口腔癌的90%以上[2]。近年來，隨著OSCC診療手段的不斷進(jìn)步，OSCC患者的預(yù)后已有較大改善，但5年生存率仍低于60%，且手術(shù)治療帶來的面部畸形、語言障礙、咀嚼及吞咽困難等嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量[3-4]。目前研究表明，煙草、酒精、咀嚼檳榔及病毒感染等因素與OSCC發(fā)生、發(fā)展間關(guān)系密切，但OSCC發(fā)生及進(jìn)展過程中的具體分子機(jī)制尚未明確[5-6]，仍需進(jìn)一步探索。

微小RNA（microRNA,miRNA）是一類單鏈、非編碼、長度在20～22個(gè)核苷酸的小RNA，可以與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)序列互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響多種細(xì)胞活動(dòng)，例如細(xì)胞增殖、分化及凋亡等[7]。此外，miRNA作為重要的生物學(xué)標(biāo)志物，在腫瘤診斷及預(yù)后監(jiān)測等方面發(fā)揮重要作用，可在一定程度上預(yù)測患者的生存、復(fù)發(fā)及對化療藥物的敏感性[8-10]。例如，miRNA-34b-3p可靶向CDK4，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖抑制、細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡[11]。此外，血清中miRNA-27a的表達(dá)水平可作為潛在的靈敏且特異的分子標(biāo)志物，用于早期原發(fā)性乳腺癌的檢測[12]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA-337-3p在胃癌細(xì)胞系中低表達(dá)，并與胃癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況密切相關(guān)[13]。此外，miRNA-337-3p可抑制酪蛋白激酶Ⅱ的表達(dá)來加速結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的衰老[14]。Xiang等[15]的研究表明，miRNA-337-3p在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織及細(xì)胞系中低表達(dá)，可與基質(zhì)金屬蛋白酶14（matrix metalloproteinase-14,MMP-14）的啟動(dòng)子序列結(jié)合而抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等過程。隨著研究的深入開展，miRNA-337-3p在腫瘤發(fā)生及進(jìn)展過程中的作用機(jī)制逐漸明確，然而，關(guān)于其在OSCC中發(fā)揮的作用目前尚無研究報(bào)道。因此，本研究擬分析miRNA-337-3p在OSCC組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況及其對OSCC細(xì)胞遷移能力的影響，以期為OSCC侵襲、轉(zhuǎn)移的早期診斷及預(yù)后監(jiān)測提供依據(jù)及幫助。

材料與方法

一、細(xì)胞及主要試劑

實(shí)驗(yàn)用OSCC細(xì)胞系 （HN4、HN6、HN30及CAL27）及作為對照的正常人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞（human oral keratinocyte,HOK）均來自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)所用試劑包括胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、總RNA抽提試劑、miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒 （上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），miRNA類似物陰性對照 [miRNA mimic negative control（NC）]、miRNA抑制物陰性對照 （miRNA inhibitor NC）、miRNA-337-3p類似物（miRNA-337-3p mimic）及 miRNA-337-3p抑制物 （miRNA-337-3p inhibitor）、miRNA轉(zhuǎn)染試劑（廣州銳博生物科技有限公司）。

二、OSCC組織標(biāo)本的收集

收集2018年于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院行口腔頜面外科手術(shù)切除的20例OSCC患者的腫瘤組織標(biāo)本，并以同一患者的癌旁鄰近正?？谇簧掀そM織作為對照。術(shù)后病理檢查證實(shí)腫瘤組織為OSCC、癌旁組織為正?？谇簧掀そM織（癌旁正常組織）。所有患者均簽署知情同意書，標(biāo)本收集均經(jīng)我院生命科學(xué)倫理學(xué)審查委員會(huì)批準(zhǔn)。本研究的納入標(biāo)準(zhǔn)如下。①病理檢查確診為原發(fā)性O(shè)SCC；②患者均為初發(fā)病例；③術(shù)前均未接受放射治療、化學(xué)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)如下。①合并其他部位的惡性腫瘤患者；②存在嚴(yán)重心、肝、肺功能障礙者；③臨床資料不完整者。手術(shù)切除的組織經(jīng)生理鹽水漂洗、濾紙吸水后，裝入凍存管，置于液氮中保存。

三、OSCC組織的總RNA提取、實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR

采用Trizol法抽提OSCC組織及其癌旁正常組織的總RNA，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。采用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA的完整性，用紫外分光光度法檢測RNA的濃度及純度。觀察18 S、28 S電泳條帶，如條帶清晰、泳道內(nèi)沒有拖尾，且28 S條帶亮度是18 S條帶亮度的2倍及以上，提示RNA樣品完整性較好。選取完整性尚好且吸光度（absorbance，A）260mm/A280mm比值在1.8～2.0之間的樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。嚴(yán)格按照試劑盒說明書配制反轉(zhuǎn)錄體系20 μL。反應(yīng)條件為，第一步，16 ℃30 min；第二步，42 ℃45 min；第三步，85 ℃10 min。將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備的cDNA取出2 μL作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為，94 ℃3 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃15 s，62 ℃40 s，共40個(gè)循環(huán)。miRNA-337-3p及U6的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。所得原始數(shù)據(jù)采用相對定量2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析，使用內(nèi)參U6，對miRNA-337-3p相對表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

四、細(xì)胞培養(yǎng)

OSCC細(xì)胞系（HN4、HN6、HN30及CAL27）使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，HOK使用口腔角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基 （上?？道噬锟萍加邢薰荆┡囵B(yǎng)，培養(yǎng)條件均為37 ℃及5%CO2。細(xì)胞均為貼壁生長，密度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使用胰酶消化法制備細(xì)胞懸液，用錐蟲藍(lán)染色活細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

五、miRNA-337-3p類似物及抑制物的轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天，選取生長狀態(tài)良好的HN30細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)，以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到50%為宜。以轉(zhuǎn)染miRNA-337-3p類似物為例，步驟如下。首先，用120 μL轉(zhuǎn)染緩沖液稀釋5 μL 20 μmol/L miRNA-337-3p類似物，輕輕吹打混勻；再加入12 μL riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹打混勻，室溫孵育15 min。將上述制備的混合液加入到無雙抗完全培養(yǎng)基中，輕輕混勻，將6孔板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

六、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

在6孔板中分別鋪種轉(zhuǎn)染特定濃度的miRNA-337-3p類似物及抑制物的HN30細(xì)胞，待細(xì)胞長滿之后，用10 μL的小槍頭以相同的力度劃一直線，以不含血清的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞，在0 h時(shí)，首先在顯微鏡下拍下劃痕的初始狀態(tài)，并記錄拍攝的位置后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h在初始拍攝位置處重復(fù)拍攝。根據(jù)拍攝后的圖計(jì)算遷移率，細(xì)胞48 h遷移率（%）=（初始寬度-48 h后的寬度）/初始寬度×100%。

七、蛋白質(zhì)印跡法檢測

經(jīng)過不同處理的細(xì)胞均采用十二烷基硫酸鈉裂解后，經(jīng)10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離裂解后的蛋白產(chǎn)物，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜后用麗春紅預(yù)染，觀察蛋白條帶是否完整。以5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，加入抗基質(zhì)金屬蛋白酶14 （matrix metalloproteinase-14，MMP-14）抗體（1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜；用含吐溫的磷酸鹽緩沖液洗膜10 min，共3次；加入抗鼠二抗（1∶10 000稀釋）后在室溫孵育1 h，洗膜后使用化學(xué)發(fā)光分析儀顯影并拍照。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果均進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 17.0軟件完成。不同組間miRNA-337-3p的表達(dá)水平比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，miRNA-337-3p的表達(dá)水平與OSCC患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析采用Fisher′s精確檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、miRNA-337-3p在OSCC組織中表達(dá)下調(diào)

采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測20例原發(fā)性O(shè)SCC患者的腫瘤組織及其癌旁正常組織標(biāo)本中miRNA-337-3p的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于配對的癌旁正常組織，有19例（95%）OSCC組織中的miRNA-337-3p表達(dá)下調(diào)（見圖1A）。對這20例樣本的miRNA-337-3p平均表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-337-3p在OSCC組織中的表達(dá)水平較癌旁正常組織顯著下調(diào)（見圖1B）（P＜0.000 1）。

二、miRNA-337-3p的表達(dá)與OSCC患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

為進(jìn)一步探索miRNA-337-3p在OSCC中的影響機(jī)制，本研究以20例OSCC患者miRNA-337-3p相對表達(dá)量的平均水平為標(biāo)準(zhǔn)，將相對表達(dá)量低于平均水平的定為miRNA-337-3p低表達(dá)組，將miRNA-337-3p的表達(dá)水平與OSCC患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)系分析，結(jié)果表明，miRNA-337-3p的表達(dá)量與OSCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況顯著相關(guān)（P＜0.05），發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N1+N2）者OSCC組織中miRNA-337-3p的表達(dá)水平顯著低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（N0）（見圖2）。不同年齡、性別、吸煙或飲酒狀態(tài)、病理分級(jí)等患者間的OSCC組織miRNA-337-3p表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表1）。

圖1 定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測20例OSCC組織及其癌旁正常組織中miRNA-337-3p的表達(dá)水平

圖2 miRNA-337-3p在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC組織中表達(dá)下調(diào)

表1 miRNA-337-3p表達(dá)水平與OSCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

三、miRNA-337-3p在OSCC細(xì)胞系中表達(dá)情況

定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測了一系列OSCC細(xì)胞系及正常HOK中miRNA-337-3p的表達(dá)水平。在4種OSCC細(xì)胞系中，HN4、HN6及CAL27細(xì)胞來源于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的OSCC患者，HN30細(xì)胞來源于發(fā)生局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC患者。結(jié)果如圖3所示，與正常HOK相比，HN30中miRNA-337-3p的表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），而HN4、HN6及CAL27中miRNA-337-3p的表達(dá)無變化。

圖3 定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測OSCC細(xì)胞系及正常HOK中miRNA-337-3p的表達(dá)情況

四、miRNA-337-3p對HN30細(xì)胞遷移能力的影響

為明確miRNA-337-3p在OSCC中的影響機(jī)制，本研究在HN30細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)miRNA-337-3p類似物及抑制物，用劃痕試驗(yàn)檢測miRNA-337-3p對HN30細(xì)胞遷移能力的影響。劃痕試驗(yàn)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-337-3p能顯著影響HN30細(xì)胞的遷移能力，過表達(dá)miRNA-337-3p能使細(xì)胞遷移能力下降，抑制miRNA-337-3p表達(dá)后，細(xì)胞遷移能力上升（見圖4）。

五、miRNA-337-3p影響HN30細(xì)胞遷移能力的相關(guān)分子機(jī)制

本研究在HN30細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)miRNA-337-3p類似物及抑制物，行蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miRNA-337-3p，MMP-14表達(dá)下降；反之，抑制miRNA-337-3p的表達(dá)，MMP-14的蛋白表達(dá)水平隨之升高（見圖5）。

圖4 miRNA-337-3p對HN30細(xì)胞遷移能力的影響

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測miRNA-337-3p對MMP-14蛋白表達(dá)水平的影響

討論

OSCC惡性程度高，進(jìn)展迅速，目前針對臨床OSCC患者的主要治療手段仍是手術(shù)，但患者預(yù)后不佳，5年生存率不足60%。越來越多的研究表明，miRNA在OSCC發(fā)生及進(jìn)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用[21]，因此，深入探索OSCC中miRNA的表達(dá)變化及其對OSCC發(fā)生、發(fā)展的影響機(jī)制具有重要意義。

一、miRNA-337-3p在OSCC中的表達(dá)變化

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA-337-3p在胃癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎癌及宮頸癌等多種類型的腫瘤組織中低表達(dá)，但其在OSCC中的表達(dá)變化及其發(fā)揮的調(diào)控功能目前尚無研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-337-3p在OSCC組織中顯著低表達(dá)，提示其可能作為抑癌因子在OSCC發(fā)生及進(jìn)展過程中發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。本研究結(jié)果來源于OSCC患者的組織標(biāo)本，能客觀、真實(shí)反映疾病實(shí)際情況。

二、miRNA-337-3p表達(dá)水平與OSCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況間的關(guān)系

局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是OSCC最主要的生物學(xué)行為之一，也是影響患者預(yù)后的一大重要因素。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，OSCC患者的轉(zhuǎn)移率約為40%[22]。OSCC的侵襲及轉(zhuǎn)移過程是涉及多因素、多環(huán)節(jié)調(diào)控的復(fù)雜漸進(jìn)過程，其確切分子機(jī)制尚未完全被闡明，仍需進(jìn)一步探索。本研究表明，miRNA-337-3p的表達(dá)量與OSCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況顯著相關(guān)（P＜0.05），發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 （N1+N2）OSCC組織中miRNA-337-3p的表達(dá)水平顯著低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（N0），此外，由發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC組織分離得到的HN30細(xì)胞，其miRNA-337-3p的表達(dá)水平較低，這些結(jié)果提示miRNA-337-3p的低表達(dá)可能促進(jìn)OSCC細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移過程。

三、miRNA-337-3p對OSCC細(xì)胞遷移能力的影響及相關(guān)分子機(jī)制探索

研究表明，miRNA-337-3p通過直接靶向鈣蛋白酶小亞基1的3′非翻譯區(qū)序列，進(jìn)而抑制腎癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[23]。此外，在宮頸癌細(xì)胞中，miRNA-337-3p可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制Ras相關(guān)蛋白A1的表達(dá)，最終引起宮頸癌細(xì)胞侵襲及遷移能力減弱[24]。本研究觀察miRNA-337-3p對OSCC細(xì)胞遷移能力的影響上，也得到了相似的結(jié)果，miRNA-337-3p可使OSCC細(xì)胞遷移減慢。然而，腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲過程密不可分，為驗(yàn)證miRNA-337-3p對腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，可設(shè)計(jì)Transwell小室細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步探究，這也是有待今后完善的地方。

此外，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明，在OSCC細(xì)胞中，miRNA-337-3p可影響MMP-14的蛋白表達(dá)水平。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤的發(fā)生及侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用，而MMP-14在上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用[25]。然而，miRNA-337-3p是否僅通過調(diào)控MMP-14的表達(dá)進(jìn)而影響OSCC細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移過程，抑或是存在miRNA-337-3p調(diào)控的其他靶基因影響這一過程，仍需進(jìn)一步探索。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-337-3p在OSCC中呈低表達(dá)，并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。miRNA-337-3p在OSCC中可能發(fā)揮抑癌作用，有望成為OSCC侵襲、轉(zhuǎn)移的早期診斷及預(yù)后監(jiān)測的潛在標(biāo)志物。