榮雪路 魏榮榮 王鉅華 李甜甜 朱國強(qiáng) 丁國偉

摘 ?要：為了研究鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗對種鵝的免疫效果，試驗(yàn)用鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗對種鵝進(jìn)行接種，并對種鵝所產(chǎn)蛋孵出的雛鵝進(jìn)行攻毒，采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)法檢測鵝血清中GoAs抗體的水平，記錄雛鵝攻毒結(jié)果。結(jié)果顯示：三批疫苗免疫28 d后試驗(yàn)組種鵝均有抗體產(chǎn)生;對照組種鵝的抗體均為陰性。試驗(yàn)組雛鵝攻毒后一切正常，存活率100%，無不良臨床癥狀。對照組雛鵝攻毒后第3天精神沉郁、厭食、站立不穩(wěn)、離群、排稀灰白色或黃綠色糞便，存活率50%，死亡鵝剖檢可見關(guān)節(jié)腫大，關(guān)節(jié)內(nèi)和內(nèi)臟表面有石灰樣尿酸鹽沉積，腎臟腫大和充血，脾臟出血嚴(yán)重，有灰白色壞死灶。研究結(jié)果表明鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗免疫效果良好，能有效預(yù)防鵝星狀病毒的感染。

關(guān)鍵詞：重組Capsid蛋白;鵝星狀病毒;攻毒保護(hù)

中圖分類號：S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2020）10-0022-05

星狀病毒主要引起鵝發(fā)生嚴(yán)重的內(nèi)臟型痛風(fēng)和關(guān)節(jié)型痛風(fēng)[1]。該病毒主要侵害2～25日齡的雛鵝，鵝感染后臨床癥狀表現(xiàn)為精神不振、采食減少、消瘦衰弱、呼吸困難、行動遲緩和排白色稀便。剖檢可見：雙腎腫大，有尿酸鹽沉積，嚴(yán)重的呈大理石樣;其他內(nèi)臟被一層白色石灰樣薄膜包裹，關(guān)節(jié)周圍及關(guān)節(jié)腔有白色尿酸鹽沉積[2-3]。發(fā)病時間多為每年的11月到次年的5月，這個季節(jié)是我國中東部種鵝產(chǎn)蛋高峰期，其他時間發(fā)病較少。感染鵝的病死率受感染日齡、繼發(fā)感染等因素影響，發(fā)病率最高可達(dá)50%[4]，該病已經(jīng)成為危害養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展的一種重要傳染病。目前，接種疫苗是預(yù)防、控制甚至消滅鵝星狀病毒的主要措施之一。星狀病毒的培養(yǎng)較為困難，限制了常規(guī)弱毒疫苗和滅活疫苗的研發(fā)。2009年，Sellers等[5]成功表達(dá)了雞星狀病毒的衣殼蛋白，用其免疫的雞群產(chǎn)生了高水平的抗體，表明衣殼蛋白有可能作為星狀病毒的亞單位疫苗。亞單位疫苗不含星狀病毒的核酸物質(zhì)，安全性較好，給鵝接種后不會發(fā)生持續(xù)感染或潛伏感染，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以與星狀病毒的野毒株感染相區(qū)分，有利于疫病的控制和消滅。因此，研制一種生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高以及免疫效果好的鵝星狀病毒亞單位疫苗的生產(chǎn)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本試驗(yàn)為有效預(yù)防鵝感染鵝星狀病毒，通過制備鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗，對種鵝進(jìn)行接種，并對其所產(chǎn)鵝蛋孵出的雛鵝進(jìn)行攻毒，研究該疫苗的保護(hù)效果，為鵝場鵝的健康和經(jīng)濟(jì)效益提供保障。

1 ?材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 種毒來源

分離并鑒定臨床病料，將所得病毒命名為鵝星狀病毒GoAsV-LH株，用鵝胚尿囊液傳代，取F3代用于攻毒（尿囊液病毒含量104.03 ELD50/0.2 mL）。

1.1.2 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)所用動物為四季鵝。

1.1.3 主要試劑及儀器

瓊脂購自Sigma公司，批號為WXBC9850V。生化培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號為LRH-150F。

1.1.4 試驗(yàn)用疫苗

鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗由本公司提供，批號分別為rCapsid-001P、rCapsid-002P和rCapsid-003P，各批次疫苗抗原蛋白濃度為75 μg/mL。

1.2 疫苗性狀檢驗(yàn)和無菌檢驗(yàn)

按現(xiàn)行《中國獸藥典》[13]附錄進(jìn)行疫苗性狀檢驗(yàn)和無菌檢驗(yàn)。

1.3 安全性檢驗(yàn)

取3～5日齡雛鵝、7月齡開產(chǎn)種鵝各10羽，接種鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗，雛鵝每羽胸部肌肉注射0.2 mL，種鵝每羽胸部肌肉注射1 mL，每組均另取10羽相同來源、相同日齡的鵝，作為對照組。接種疫苗后7 d、14 d和21 d，每組取3羽鵝進(jìn)行剖檢，檢查注射部位疫苗吸收情況和病理變化。

1.4 免疫效力試驗(yàn)

將三批四季種鵝分為免疫組和對照組，在開產(chǎn)前5周，給免疫組種鵝接種三批鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗中的一批疫苗，接種劑量為1 mL/羽，對照組的種鵝不接種疫苗。接種后第2周至第 ? 4周，各組隨機(jī)取20羽鵝采集血液，采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)法檢測GoAs抗體;收集接種疫苗后第4周至第5周種鵝所產(chǎn)鵝蛋，每組40枚，其中10枚采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)法檢測GoAs抗體，余下的30枚放入38 ℃孵化箱中孵化。29 d～30 d后，各組任選20羽雛鵝，做好區(qū)分，飼養(yǎng)至 3日齡，采集雛鵝血液，分離血清，采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)法檢測GoAs抗體。同時進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，用GoAsV-LH株F3代攻毒（尿囊液中病毒含量為104.03 ELD50/0.2 mL），每羽雛鵝口服0.5 mL，頸部皮下注射0.5 mL，每組攻毒10羽，剩余為對照組。各組鵝均分別隔離飼養(yǎng)，觀察14 d，記錄發(fā)病、死亡及保護(hù)情況。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 疫苗性狀檢驗(yàn)和無菌檢驗(yàn)結(jié)果

三批疫苗均為乳白色油包水型乳劑。用清潔吸管吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不擴(kuò)散。將疫苗加入10 mL離心管中，以3 000 r/min離心15 min，管底析出水相未超過0.5 mL。無菌檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)菌落生長。

2.2 疫苗安全性檢驗(yàn)結(jié)果

鵝群注射疫苗后，連續(xù)21 d，各組鵝的精神狀況、飲水和進(jìn)食量均良好;免疫后 7 d、14 d和21 d，觸摸檢查試驗(yàn)組鵝注射部位無紅腫等局部注射反應(yīng);剖檢注射部位，發(fā)現(xiàn)疫苗吸收良好，無病理變化。

2.3 鵝星狀病毒重組Capsid蛋白亞單位疫苗的免疫效力

2.3.1 種鵝接種疫苗后血清抗體檢測結(jié)果

試驗(yàn)組鵝接種三批疫苗28 d后，用鵝星狀病毒瓊脂擴(kuò)散法測得的抗體效價平均值均不低于3.6log2，對照組鵝的抗體均為陰性，具體結(jié)果見表1。