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(1.云南省藥物研究所， 昆明 650111； 2.云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心， 昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650111； 4.云南中醫(yī)藥大學(xué)， 昆明 650500)

滇重樓(ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis)為百合科重樓屬多年生宿根性草本植物[1]，以干燥根莖入藥，是藥材重樓的原植物來(lái)源之一，主要分布于我國(guó)西南部的云南、四川和貴州一帶，云南是其核心產(chǎn)區(qū)。滇重樓以重樓皂苷作為有效成分，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、驚風(fēng)抽搐等癥[2]?，F(xiàn)代研究表明，重樓在抗腫瘤、止血止痛、抑菌消炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、保護(hù)肝臟與腎臟等方面具有重要作用[3-5]，廣泛用于多種疾病的治療，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。近年來(lái)，重樓藥材價(jià)格一路上揚(yáng)，滇重樓野生資源遭到了掠奪式的采挖，現(xiàn)已處于瀕臨枯竭的狀態(tài)。同時(shí)，重樓藥材價(jià)格居高不下也激發(fā)了廣大藥農(nóng)的種植熱情，經(jīng)過(guò)近十余年的發(fā)展，工業(yè)用重樓藥材已從野生采挖供給逐漸走向人工栽培生產(chǎn)，在滇重樓的規(guī)范化和規(guī)?；耘喾矫嬉呀?jīng)取得階段性進(jìn)展[6]。滇重樓主要以種子育苗移栽作為繁殖手段，種子質(zhì)量直接影響藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。滇重樓種子具有復(fù)雜的休眠形態(tài)，采摘時(shí)種胚發(fā)育不成熟、種皮及胚乳存在萌發(fā)抑制物[7]，具有二次發(fā)育的特性[8]。隨著種植面積的逐漸增大，滇重樓種子在不同產(chǎn)區(qū)間交易流通，難免出現(xiàn)種源混雜、以次充好、種子質(zhì)量參差不齊等問(wèn)題，最終導(dǎo)致其在自然狀態(tài)下萌發(fā)十分困難，嚴(yán)重阻礙了滇重樓的自然和人工繁殖[9-10]，給藥農(nóng)造成不可挽回的經(jīng)濟(jì)損失。更為重要的是，種子質(zhì)量的不穩(wěn)定，直接造成重樓藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的不均一，影響用藥的有效性和安全性，嚴(yán)重制約了重樓藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，對(duì)滇重樓種子的研究主要集中在休眠機(jī)理[11-12]、育苗技術(shù)及提高萌發(fā)率[13-15]等方面，未見(jiàn)關(guān)于種子質(zhì)量等級(jí)的報(bào)道。因此，本研究在對(duì)不同產(chǎn)地滇重樓種子收集的基礎(chǔ)上，根據(jù)前期研究的滇重樓種子檢驗(yàn)規(guī)程[16]，開(kāi)展滇重樓種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究，以期建立滇重樓種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范滇重樓種子交易秩序，為滇重樓規(guī)范化栽培提供有力的保障，從而保證重樓藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。

1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料采自云南省大理州、麗江市各滇重樓栽培區(qū)的20份滇重樓種子(表1)。種子采收后搓去假種皮，洗凈，晾干種子表面水分備用。

表1 滇重樓種子材料采集信息

2 方 法

根據(jù)李瑪?shù)萚16]的方法，對(duì)供試種子進(jìn)行形態(tài)指標(biāo)測(cè)量、凈度、千粒重、含水量、生活力和發(fā)芽率等6個(gè)項(xiàng)目的測(cè)定，考察供試種子的質(zhì)量狀況。

2.1 凈度分析

采用四分法從送驗(yàn)樣品中扦取試驗(yàn)樣品，并將其分為凈種子、其他植物種子和雜質(zhì)3種成分，測(cè)定各成分的重量百分比，重復(fù)4次。

2.2 種子形態(tài)測(cè)定

采用種子外觀形態(tài)法，隨機(jī)數(shù)取100粒種子，用精度0.01 mm電子數(shù)顯卡尺測(cè)量種子大小、逐粒觀察形狀、顏色以及表面結(jié)構(gòu)等特征并記錄，3次重復(fù)。

2.3 千粒重測(cè)定

采用五百粒法測(cè)定滇重樓種子千粒重。分別將各個(gè)批次種子試樣充分混勻，隨機(jī)從凈種子中數(shù)取500粒，重復(fù)4次，分別稱重記錄，精確到0.001 g，計(jì)算500粒種子的平均重量，該重量乘以2即為實(shí)測(cè)的滇重樓種子千粒重。

2.4 含水量測(cè)定

滇重樓種子水分測(cè)定采用高恒溫烘干法(130±2)℃。稱取各產(chǎn)地的滇重樓種子樣品5 g，3個(gè)重復(fù)，裝入烘干恒重的小鋁盒中，130 ℃恒溫烘干8 h，計(jì)算種子含水量。

2.5 生活力測(cè)定

采用TTC染色法測(cè)定滇重樓種子生活力。隨機(jī)數(shù)取經(jīng)凈度分析后的滇重樓種子，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子，沿種臍縱切，取其中一半，浸入0.01% TTC溶液中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光染色7 h，染色結(jié)束后用清水沖洗3～5次種子，觀察種子染色情況，統(tǒng)計(jì)種子生活力。

生活力(%)=(染色種子數(shù)/供試種子)×100%

2.6 發(fā)芽率測(cè)定

隨機(jī)選取形態(tài)完整的滇重樓種子50粒，3個(gè)重復(fù)，用0.1%高錳酸鉀溶液浸種10 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，將種子均勻置于鋪有2層充分濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置于20 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)。初次計(jì)數(shù)時(shí)間為種子置床后的第30天，末次計(jì)數(shù)時(shí)間為種子置床后的第100天，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子)×100%

2.7 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)制定

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，得出滇重樓種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

表2 滇重樓種子檢驗(yàn)結(jié)果

表3 各指標(biāo)相關(guān)性分析

3 結(jié)果與分析

3.1 種子凈度

試驗(yàn)中滇重樓種子均去果皮和假種皮，并陰干表面水分，試樣均沒(méi)有其他植物種子，亦無(wú)雜質(zhì)，凈度為100%。

3.2 種子形態(tài)

滇重樓果實(shí)蒴果室背開(kāi)裂，棕黃色；種子多數(shù)，種皮肉質(zhì)多汁，櫻紅色，長(zhǎng)6.64～7.42 mm，寬5.09～5.52 mm。除去假種皮后種子呈卵球形，種子堅(jiān)硬，光滑，呈白色，長(zhǎng)4.09～4.88 mm，寬3.34～4.11 mm，種子一側(cè)有黃白色圓形種臍。

3.3 種子質(zhì)量檢測(cè)

對(duì)20份滇重樓種子長(zhǎng)度、寬度、含水量、千粒重、生活力和發(fā)芽率的測(cè)定結(jié)果表明(表2)，各項(xiàng)指標(biāo)都存在明顯的差異。滇重樓種子含水量在59.32%～69.04%之間，千粒重為30.21～48.21 g，生活力為83.66%～97.33%，發(fā)芽率為82.33%～97.00%。其中，16號(hào)材料種子長(zhǎng)度最短，為4.09 mm，4號(hào)和5號(hào)材料最長(zhǎng)，為4.88 mm，16號(hào)材料種子寬度最小，僅為3.34 mm，2號(hào)材料最寬，為4.11 mm，6號(hào)材料含水量最低，為59.32%，9號(hào)材料含水量最高，達(dá)69.54%，16號(hào)材料千粒重最低，僅為30.21g，4號(hào)材料最高，為48.21 g，11號(hào)材料生活力最低，為83.66%，最高的是1號(hào)、3號(hào)和4號(hào)材料，達(dá)到97.33%，11號(hào)材料發(fā)芽率最低，為82.33%，3號(hào)材料發(fā)芽率最高，達(dá)97.00%。

3.4 種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的制定

由表3可得，滇重樓種子長(zhǎng)度、寬度與千粒重呈極顯著相關(guān)，發(fā)芽率和生活力相關(guān)系數(shù)為0.974，為極顯著相關(guān)關(guān)系，含水量與種子長(zhǎng)度、寬度、千粒重呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，與發(fā)芽率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此，以種子生活力作為種子質(zhì)量分級(jí)的首要依據(jù)，千粒重和含水量作為次要依據(jù)。運(yùn)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行K聚類(lèi)分析，最終聚類(lèi)中心值見(jiàn)表4。

以滇重樓種子生活力、千粒重、含水量3項(xiàng)指標(biāo)的聚類(lèi)中心值作為滇重樓種子分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的參考值，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際和可操作性，在此基礎(chǔ)上，初步制定了滇重樓種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 K類(lèi)中心聚類(lèi)的最終類(lèi)中心值

表5 滇重樓種子質(zhì)量分級(jí)劃分表

4 討 論

種子凈度分析是開(kāi)展千粒重、生活力等其他指標(biāo)測(cè)定的基礎(chǔ)，在本次試驗(yàn)中，所用材料的種子凈度均為100%，種子凈度較高是因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)材料是收集滇重樓成熟果實(shí)后，除去果皮和假種皮，洗凈、陰干，沒(méi)有夾雜其他植物種子。因此，種子凈度不宜作為種子質(zhì)量的分級(jí)指標(biāo)。

在種子分級(jí)指標(biāo)中，發(fā)芽率可直接反映種子的田間出苗率，是確定播種量和用種量的主要依據(jù)[17]，但由于滇重樓種子具有生理—形態(tài)休眠的特性[18]，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，不利于實(shí)際操作，通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽率與生活力相關(guān)性極顯著。因此，本研究以滇重樓種子生活力代表發(fā)芽率作為種子質(zhì)量的分級(jí)指標(biāo)；滇重樓種子成熟時(shí)，胚極不發(fā)育，具有后熟的特性[19]，種子后熟過(guò)程中胚發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)完全來(lái)自種子自身儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，種子千粒重可反映種子貯藏物質(zhì)的多少、飽滿程度和成熟度[20]。相關(guān)性分析表明，種子大小和種子千粒重息息相關(guān)，因此以千粒重作為另一分級(jí)指標(biāo)；含水量高低決定種子安全儲(chǔ)存和種子壽命[21]。本研究表明，含水量與種子千粒重呈極顯著負(fù)相關(guān)，因此，將含水量作為參考指標(biāo)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，滇重樓種子千粒重與發(fā)芽率和生活力無(wú)相關(guān)性，表明滇重樓種子在適宜的發(fā)芽條件下，種子大小對(duì)發(fā)芽率和生活力無(wú)影響。

滇重樓種子質(zhì)量與重樓藥材質(zhì)量的優(yōu)劣、產(chǎn)量的高低息息相關(guān)，目前關(guān)于滇重樓種子的質(zhì)量等級(jí)劃分非常不清晰，很難對(duì)市售種子的質(zhì)量進(jìn)行有效地控制和評(píng)價(jià)，造成種子質(zhì)量良莠不齊，嚴(yán)重影響規(guī)范化生產(chǎn)成效。因此，開(kāi)展滇重樓種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究是重樓藥材規(guī)范生產(chǎn)急需解決的問(wèn)題。本研究初步確定了滇重樓種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以期為規(guī)范滇重樓種子市場(chǎng)，從源頭控制重樓藥材質(zhì)量提供理論依據(jù)。