王佳雪 王 冠 李召霞 方春秋 張 濤

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 長春 130117； 2.吉林省長白山中藥資源工程研究中心， 長春 130117)

赤芍是著名的野生道地中藥材，用量大、用途廣，應(yīng)用歷史久遠(yuǎn)。吉林省的野生資源在逐年遞減，優(yōu)質(zhì)的赤芍資源也在遞減，藥材市場供應(yīng)難以得到保障，赤芍的市場年需求量大約為4 500 t，貨源緊缺。白芍是常用家種大宗藥材[1]，年需求量在2 000 t左右。擴(kuò)大白芍、赤芍資源的人工栽培代替野生挖掘可緩解目前市場上白芍、赤芍短缺的現(xiàn)狀，保護(hù)中藥材資源和生態(tài)資源[2]，同時(shí)對(duì)促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重大意義。

近年來，吉林省白芍和赤芍藥材栽培發(fā)展迅速，有伊通、蛟河、松原、通化、舒蘭、柳河等多處藥材種植基地，而在吉林省藥材市場，赤芍種子品種復(fù)雜，白芍和赤芍種子藥農(nóng)難以分辨，流通過程中造成用藥混亂。根據(jù)吉林省藥材市場情況，現(xiàn)急需鑒別白芍和赤芍種子完整而準(zhǔn)確的方法。本研究利用形態(tài)特點(diǎn)和分子鑒定等方法研究白芍、赤芍種子鑒別方法，即是利用ITS 2序列對(duì)白芍、赤芍種子進(jìn)行DNA條形碼鑒別研究，以ITS 2序列為核心條形碼，作為藥用植物鑒定的分子依據(jù)[3-5]，為吉林省白芍和赤芍藥材種植提供科學(xué)鑒定依據(jù)。白芍來源于毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的干燥根，赤芍來源于毛茛科植物芍藥(P.lactifloraPalI)或川赤芍(P.veitchiiLynch)的干燥根[6]。白芍長于養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、平抑肝陽[7]；赤芍則長于清熱涼血、活血散瘀、清瀉肝火[8-9]，二者具有較大的差異。探索研究白芍、赤芍藥材的共性與差異，是確保白芍、赤芍質(zhì)量的關(guān)鍵，為中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和實(shí)施提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

白芍和赤芍種子采集于吉林省中藥材種植基地，白芍種子樣本9份，赤芍種子樣本9份，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載ITS 2序列：芍藥10份，川赤芍、草芍藥各4份，新疆芍藥2份，窄葉芍藥1份(表1)。

1.2 方 法

1.2.1鑒 別

根據(jù)《中國植物志》和《中國藥典》對(duì)所采集植物及其藥用部位進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和藥材性狀鑒別。

1.2.2藥材前處理

剪掉白芍、赤芍植株，分別將含種子的白芍殼、赤芍殼置于自封袋中，放置適量硅膠干燥，直至殼內(nèi)的白芍、赤芍種子全部裂開，將所有的白芍、赤芍種子放入袋中，放置于通風(fēng)、干燥處。

表1 白芍、赤芍及芍藥屬樣本來源及ITS 2序列GenBank登錄號(hào)

1.2.3DNA提取

白芍、赤芍基因組 DNA 提取采用改良的 CTAB法[10]提取DNA，NanoDrop估測濃度，瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)量鑒定。

1.2.4PCR擴(kuò)增及測序

實(shí)驗(yàn)樣品擴(kuò)增正向引物5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向引物為5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。 PCR反應(yīng)體系為20 μL，體系內(nèi)含PremixTaq10 μL、ddH2O 8 μL、FP(10 μM)0.5 μL、RP(10 μM)0.5 μL、DNA模板(100 ng·L-1)1 μL。ITS 2引物：每個(gè)模板做2個(gè)PCR管，離心混勻后，加入10 μL石蠟油密封，繼續(xù)離心，混勻體系后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟為95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，40 cycles；72 ℃ 5 min；40 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，進(jìn)行雙向測序，測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

測序所得到的序列峰圖，運(yùn)用SeqMan軟件去除引物、序列拼接，標(biāo)準(zhǔn)為堿基量不能低于20。對(duì)于所獲得ITS 2序列，可以使用隱馬爾可夫模型(HMMer)的注釋方法切除ITS 2兩端的5.85和28 S區(qū)域.獲得標(biāo)準(zhǔn)的ITS 2間隔區(qū)序列[11]。采用MEGA 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多序列比對(duì)，計(jì)算物種(K 2 P)遺傳距離并構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行研究分析。使用Bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率，僅顯示支持率≥50%的數(shù)值，來鑒定各樣本。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于樣本形態(tài)特征、ITS 2序列的物種鑒定分析

通過形態(tài)觀察顯示，白芍、赤芍種子樣本二者的形態(tài)相似，大小有微小差異，肉眼難以辨別，并且有一定難度，易出現(xiàn)偏差(圖1)。

總計(jì)18個(gè)白芍、赤芍種子樣本，ITS 2序列PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳總DNA提取成功率為100%；ITS 2序列擴(kuò)增成功率為100%；測序成功率100%。由測序所得峰圖分析可知，各個(gè)序列的堿基質(zhì)量均>20，通過BLAST鑒定9份白芍樣本和9份赤芍樣本堿基序列均確定為芍藥(P.lactifloraPall)。

2.2 種內(nèi)和種間差異

白芍、赤芍種子及芍藥屬的39個(gè)樣本的ITS 2序列長度為230 bp。以赤芍樣本為基準(zhǔn)，運(yùn)用MEGA 7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，39份樣本中共有54個(gè)堿基變異位點(diǎn)，經(jīng)MEGA 7.0分析顯示，吉林省中藥材種植基地種植的白芍、赤芍種子樣本之間沒有種內(nèi)變異位點(diǎn)，區(qū)分不出差異(表2)，白芍種子和赤芍種子的遺傳距離為0，說明白芍種子與赤芍種子樣本無差異(表3)，與從GenBank上下載的芍藥有3個(gè)變異位點(diǎn)，從GenBank上下載的新疆芍藥有7個(gè)變異位點(diǎn)，遺傳距離為0.04和0.03，從GenBank上下載的窄葉芍藥有6個(gè)變異位點(diǎn)，遺傳距離為0.04、0.03和0.02，從GenBank上下載的草芍藥有6個(gè)變異位點(diǎn)，遺傳距離為0.04、0.03、0.02和0.01，種間變異明顯，易于區(qū)分。

圖1 白芍、赤芍種子的形態(tài)特征

表2 基于ITS 2序列白芍、赤芍種子及芍藥屬的堿基變異

2.3 NJ樹聚類分析

根據(jù)ITS 2序列，對(duì)39個(gè)樣本構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2，除去9個(gè)白芍種子樣本、9個(gè)赤芍種子樣本以及GenBanK下載的芍藥聚在一支，其他芍藥屬各為一支，其中從GenBank上下載的川赤芍聚為一支，從GenBank上下載的新疆芍藥聚為一支，從GenBank上下載的草芍藥聚為一支，同時(shí)從GenBank上下載的川赤芍、從GenBank上下載的窄葉芍藥與新疆芍藥聚為一支。由此可以明顯的區(qū)分出芍藥屬不同種雖然在一定程度上有親緣關(guān)系，但仍然存在差別；同時(shí)結(jié)合變異位點(diǎn)以及(K 2 P)遺傳距離可以清晰地發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)采集樣本白芍、赤芍種子應(yīng)用ITS 2堿基序列難以區(qū)分，種內(nèi)之間無差異，由此可得出白芍、赤芍種子2個(gè)研究樣本之間的親緣關(guān)系無差異，結(jié)合基于ITS 2堿基序列變異位點(diǎn)、K 2 P遺傳距離比較、NJ聚類樹顯示可得出，說明吉林省中藥材種植基地種植的白芍種子和赤芍種子是同種。

表3 基于ITS 2序列白芍、赤芍種子及芍藥屬樣本的K 2 P遺傳距離

圖2 基于ITS 2序列構(gòu)建的白芍、赤芍及芍藥屬的鄰接(NJ)樹

采用DNA條形碼鑒定技術(shù)，通過ITS 2條形碼片段的比對(duì)表明白芍和赤芍種子樣本基因序列相同，說明吉林省中藥材種植基地的白芍種子和赤芍種子是同種。運(yùn)用DNA條形碼鑒定技術(shù)來鑒別種子的真?zhèn)危瑥亩鴮?shí)現(xiàn)中藥鑒定標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化。分子生物學(xué)方法，即通過基因組進(jìn)行研究，比較DNA序列上的差異[12]，不受樣本形態(tài)的限制，減少了人為因素的影響，使得鑒定結(jié)果具有準(zhǔn)確性。理想的DNA條形碼要有足夠的種間變異和較小的種內(nèi)差異。

這一技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義，將其作為一種監(jiān)察手段，可為中藥材種質(zhì)優(yōu)選、良種培育、規(guī)?；N植等各階段提供保障;為中藥材的種植、加工、流通、臨床使用等各個(gè)環(huán)節(jié)提供保障;可維護(hù)藥農(nóng)切身利益，減少因假種劣種流通造成的損失;可為中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定的參考依據(jù)，推進(jìn)中藥材種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定實(shí)施。