(貴州大學(xué)食用菌研究院， 貴陽 550025)

松乳菇(Laclariusdeliciosus)為擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、紅菇科、乳菇屬，易與松樹等形成外生菌根的食用菌[1]，具有藥用食用的雙重價值。靚麗乳菇是松乳菇家族中子實(shí)體顏色為橙黃色的一類，屬擔(dān)子菌門，紅菇目，紅菇科，乳菇屬的一種大型真菌，貴州又稱松菌、松毛菌[2]。紅汁乳菇呈紫銅色，無辛辣味，口感比橙黃色松乳菇細(xì)膩[3]。多汁乳菇子實(shí)體呈較暗的紅褐色，菌柄折斷后會流出較多汁液，俗稱奶漿菌。

松乳菇常生長在櫟樹和馬尾松成片的混交林地，且以馬尾松較小、櫟樹較細(xì)、松針葉和櫟樹葉為主的腐殖質(zhì)表層林地里發(fā)生較多。由于菌絲脫離共生樹種的根系不能形成子實(shí)體，目前還難以實(shí)現(xiàn)人工栽培[4]。本試驗(yàn)對3種松乳菇菌種設(shè)置相同的母種、原種和液體種培養(yǎng)基，分別接種靚麗乳菇、多汁乳菇和紅汁乳菇菌種，研究3種松乳菇菌絲體生長情況，以掌握3種松乳菇生物學(xué)特性，為人工馴化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

靚麗乳菇、多汁乳菇和紅汁乳菇3個松乳菇菌株由鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣黔康源生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司和貴州大學(xué)分別從鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣羊場鎮(zhèn)和貴陽市花溪區(qū)黔陶鄉(xiāng)收集，在貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝實(shí)驗(yàn)室純化培養(yǎng)并供試驗(yàn)。

試管母種培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，磷酸二氫鉀0.5 g，牛肉膏2 g，水1 000 mL,pH值7。

原種固體培養(yǎng)基：松木屑35%、麥粒35%、玉米芯10%、麥麩18%、石膏1%、過磷酸鈣0.5%、糖0.5%，尿素0.5%，硫酸鎂 0.1%，培養(yǎng)基含水量60%～65%,pH值7。

液體種培養(yǎng)基：馬鈴薯100 g，紅糖15 g，葡萄糖10 g，麥麩20 g，蛋白胨20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，維生素B10.5 g，pH值7。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌種的分離(孢子分離法)

1) 種菇的選擇

挑選靚麗乳菇、多汁乳菇和紅汁乳菇3種松乳菇菇蓋肥厚，菇形圓整，菇柄粗壯的單生子實(shí)體作為種菇。種菇的菌膜將開而未開，達(dá)8～9成成熟度。

2) 孢子收集器準(zhǔn)備

在超凈工作臺內(nèi)將瓷盆襯4～6層紗布，上面放一只中號的培養(yǎng)皿，皿內(nèi)放一個不銹鋼三角架(供插種菇之用)，再在瓷盆上加蓋一只玻璃大漏斗，將孔塞上棉塞，對超凈工作臺殺菌消毒。

表1 不同松乳菇菌株母種菌絲的生長情況比較

3) 孢子的采取及試管母種培養(yǎng)

在超凈工作臺內(nèi)，用鑷子分別將3種松乳菇種菇浸入0.1%～0.2%的升汞水溶液中浸泡1 min，取出用無菌水沖洗1～2次，再用滅菌的紗布吸干菇體表面的漬水，輕輕掀開玻璃漏斗，用消毒過的鑷子夾種菇迅速插入三角架上，馬上蓋好，用紗布將漏斗周圍塞好，并在紗布上倒0.1%的升汞水。然后將孢子收集皿放入恒溫室中培養(yǎng)，使其孢子落下。恒溫室溫度控制在18～20 ℃之間。當(dāng)培養(yǎng)皿內(nèi)有1層淡咖啡色的粉末時即是孢子，應(yīng)立即進(jìn)行接種，將斜面培養(yǎng)基及所需用具用0.1% KMnO4抹洗表面，并將滅菌過的注射器一同放入超凈工作臺內(nèi)消毒，按無菌操作接種后，隨即放于23～28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，經(jīng)9～12 d培養(yǎng)基表面可看到白色星芒狀的菌絲叢。

孢子萌發(fā)菌絲后，取先端菌絲及時轉(zhuǎn)入普通PDA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，菌絲生長穩(wěn)定后，轉(zhuǎn)入本試驗(yàn)試管斜面母種培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個品種接種10支試管， 3次重復(fù)。觀察測定菌絲長勢、滿管時間、菌絲生長速度。滿管后的菌種，放入4 ℃左右的冰箱保藏備用。

1.2.2液體種培養(yǎng)基接種、培養(yǎng)

先按本試驗(yàn)液體種培養(yǎng)基配方稱量麥麩浸泡30 min，然后將去皮土豆切片與麩皮混合后煮熟30 min，過濾取濾液。將精確稱量的磷酸二氫鉀、硫酸鎂等輔料與土豆、麥麩的濾液充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后把制作好的液體菌種培養(yǎng)基靜置一段時間，待其中的固體物質(zhì)沉淀后取上清液裝入三角瓶，裝入500 mL三角瓶內(nèi)，每瓶裝量為100 mL，加入15粒左右的小玻璃珠，用棉塞封口后置1.5 kg壓力下滅菌30 min，取出待溫度為30 ℃時接種。每瓶接入1.5～2 cm2的斜面菌種一塊，讓其懸浮于液體培養(yǎng)基表面且使菌絲朝上，在適溫下靜置培養(yǎng)48 h。接種完后塞緊塞子，貼上標(biāo)簽。每個品種接種5瓶， 3次重復(fù)。當(dāng)菌絲長至液體培養(yǎng)基中時，置搖床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。往復(fù)式搖床振蕩頻率為80～100次·min-1，振幅6～10 cm。將接種好的三角瓶放到25～28 ℃的環(huán)境中進(jìn)行避光靜止培養(yǎng)72 h后，將已經(jīng)萌發(fā)并且沒有雜菌污染的三角瓶放到回旋式搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，讓3種松乳菇培養(yǎng)瓶保持相同轉(zhuǎn)速勻速轉(zhuǎn)動，搖床搖速控制在160～200次·min-1之間,控制液體菌種培養(yǎng)液的培養(yǎng)溫度在24～26 ℃之間。

1.2.3原種培養(yǎng)基裝袋、滅菌，接種培養(yǎng)

按原種培養(yǎng)基配方比例稱取培養(yǎng)料主料、輔料，充分拌勻，調(diào)節(jié)含水量至60%，裝入12 cm×24 cm的聚丙烯塑料袋,每袋裝干料300 g，機(jī)械免鍋爐滅菌鍋LGB-1500*4500滅菌2 h，冷卻到30 ℃以下接種3種松乳菇菌種。每個處理接種5袋，3次重復(fù)。接種完將菌包放入人工氣候箱，保持溫度25 ℃，相對濕度65%～70%，避光培養(yǎng)。

1.3 測定項(xiàng)目

1.3.1固體菌種培養(yǎng)基菌絲體生長數(shù)據(jù)測量

3種松乳菇接種到培養(yǎng)基5 d后，根據(jù)菌落邊緣，將起始線畫在試管或菌袋上。之后以3 d為一個階段，對菌絲生長潛力(顏色，密度，生長潛力，菌落邊緣均勻性)進(jìn)行觀察并記錄。觀察到母種菌絲充滿試管，原種菌絲充滿整個菌袋后，用記號筆畫終止線。測量菌絲體的平均長度和滿(管)袋天數(shù)。

菌絲體生長數(shù)據(jù)測量:從菌絲的中心到生長的最遠(yuǎn)端測得的半徑長度作為菌絲生長的長度再除以菌絲滿管或者滿袋的時間得出菌絲日均生長速度。

菌絲體生長速率(mm·d-1)=菌絲體長度(mm)/菌絲生長期(d)。

菌絲干重測量：將培養(yǎng)10 d的松乳菇試管母種加熱，使其中的瓊脂完全溶解，再將其放入90～100 ℃熱水中漂洗2次，放入烘箱內(nèi)烘干后，采用電子天平稱重。

1.3.2液體培養(yǎng)基中的菌球個數(shù)、菌絲生長速率

液體菌種培養(yǎng)7 d后，菌球基本布滿培養(yǎng)瓶，各品種松乳菇培養(yǎng)瓶依次用注射器抽取30 mL液體培養(yǎng)液，抽出后注射到培養(yǎng)皿上靜置，計(jì)數(shù)菌球個數(shù)并記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件和SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同松乳菇菌株原種菌絲生長情況

從表1可知，在相同母種培養(yǎng)基中，靚麗乳菇生長速度最快，日均生長量為1.13 mm，紅汁乳菇菌絲的生長速度相對較慢，靚麗乳菇與紅汁乳菇菌絲的生長速度達(dá)顯著差異；多汁乳菇菌絲的生長速度與靚麗乳菇和紅汁乳菇無顯著差異。

靚麗乳菇和多汁乳菇長勢一致，均為菌絲濃密、粗壯，菌落邊緣整齊，靚麗乳菇菌絲萌發(fā)期白色，滿管白色間黃色，多汁乳菇萌發(fā)期白色，滿管白色間紅褐色；紅汁乳菇菌絲長勢稍弱，萌發(fā)期白色，滿管白色間紅綠色。

3種松乳菇菌絲干重以靚麗乳菇(0.295 g)與多汁乳菇(0.273 g)值較大，紅汁乳菇菌絲干重值較小(0.186 g)。靚麗乳菇、多汁乳菇與紅汁乳菇菌絲干重差異達(dá)顯著水平。

2.2 液體培養(yǎng)基中松乳菇菌絲的生長情況

從表2可以看出，在搖床培養(yǎng)相同時間的每30 mL液體培養(yǎng)基中，靚麗乳菇在液體培養(yǎng)基中的菌球數(shù)量最多，平均達(dá)54.7個·(30 mL)-1，紅汁乳菇次之，靚麗乳菇與紅汁乳菇在液體培養(yǎng)基中的菌球數(shù)差異不顯著，多汁乳菇在液體培養(yǎng)基中的菌球最少，平均41個·(30 mL)-1，并與靚麗乳菇和紅汁乳菇在液體培養(yǎng)基中的菌球數(shù)達(dá)顯著差異。

表2 不同松乳菇菌株在液體培養(yǎng)基中菌絲生長速率

2.3 不同松乳菇菌株原種菌絲生長情況分析

由表3可知， 在相同原種培養(yǎng)基中，3種松乳菇的菌絲生長速度由快到慢依次為：靚麗乳菇(0.385 mm·d-1)、多汁乳菇(0.356 mm·d-1)、紅汁乳菇(0.293 mm·d-1)。靚麗乳菇和多汁乳菇在原種培養(yǎng)基上菌絲長勢強(qiáng)，二者菌絲生長速度無顯著差異；紅汁乳菇菌絲生長速度較慢，且與靚麗乳菇和多汁乳菇差異顯著。

3種松乳菇菌絲滿袋時間為靚麗乳菇(35 d)<多汁乳菇(37 d)<紅汁乳菇(40 d)。

3種松乳菇在原種培養(yǎng)基中菌絲顏色，靚麗乳菇為白間黃，紅汁乳菇為白色間暗紅色，多汁乳菇為白間褐黃。

表3 不同松乳菇菌株在原種培養(yǎng)基菌絲生長情況

3 討論與結(jié)論

在母種培養(yǎng)基中，靚麗乳菇與多汁乳菇生長速度快、長勢強(qiáng)，紅汁乳菇菌絲生長速度較慢、長勢弱，靚麗乳菇與紅汁乳菇菌絲的生長速度達(dá)顯著差異；菌絲干重以靚麗乳菇(0.295 g)與多汁乳菇(0.273 g)值較大，紅汁乳菇較小(0.186 g)，靚麗乳菇、多汁乳菇與紅汁乳菇菌絲干重達(dá)顯著差異。

在原種培養(yǎng)基中，3種松乳菇菌絲滿袋時間靚麗乳菇(35 d)<多汁乳菇(37 d)<紅汁乳菇(40 d)。靚麗乳菇和多汁乳菇菌絲生長速度較快、長勢強(qiáng)，紅汁乳菇菌絲生長速度較慢，并與靚麗乳菇和多汁乳菇達(dá)顯著差異。

每30 mL液體培養(yǎng)基中，靚麗乳菇菌球數(shù)最多，達(dá)54.7個，多汁乳菇菌球數(shù)最少，并與靚麗乳菇、紅汁乳菇菌球數(shù)達(dá)顯著差異。

在母種培養(yǎng)基中，靚麗乳菇滿管為白色間黃色，多汁乳菇滿管為白色間紅褐色，紅汁乳菇滿管為白色間紅綠色。在原種培養(yǎng)基中菌絲顏色，靚麗乳菇為白間黃，紅汁乳菇為白色間暗紅色，多汁乳菇為白間褐黃。