2

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/茶學(xué)院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025;2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 貴陽 550006)

Ca2+廣泛存在于植物體內(nèi)的各個(gè)部位，參與植物生長、發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過程，是植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的第二信使[1]。類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(Calcineurin B-like protein，CBL)是高等植物中已發(fā)現(xiàn)的3種主要Ca2+傳感蛋白之一，可對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度變化進(jìn)行識(shí)別和放大，進(jìn)而將信號(hào)向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而對(duì)植物生命活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控[2]。CBL蛋白與絲/蘇氨酸蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase，CIPK)相互作用形成蛋白激酶復(fù)合物來響應(yīng)逆境脅迫，通過感受細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化來調(diào)節(jié)下游逆境相關(guān)基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[3-5]。CBL基因最早在擬南芥中發(fā)現(xiàn)[6]，隨后CBL基因的鑒定和相關(guān)研究在冰葉日中花[7]、蘋果[8]、小麥[9]、水稻[10]、胡楊[11]等多種植物中相繼展開，對(duì)已知的CBL基因家族進(jìn)行比對(duì)分析可知，CBL基因家族具有典型的EF-hand結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)和增加其對(duì)鈣親和力的雙重作用[12,13]。

朝倉花椒(ZanthoxylumpiperitumDC. var.inermeMakino)是蕓香科花椒屬山椒種植物，具有無刺、豐產(chǎn)性顯著及抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?；ń贩N類繁多，除朝倉花椒外，研究主要集中在產(chǎn)業(yè)化和種植方面，對(duì)其分子機(jī)理研究相對(duì)較少，且主要集中在花椒種中，如關(guān)淑文等[14]對(duì)竹葉花椒ZaGGPPS基因克隆與表達(dá)分析的研究，蔣弘剛等[15]對(duì)大紅袍花椒皮刺分化轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析，楊輝等[16]對(duì)蜆殼花椒種子萌發(fā)的差異表達(dá)基因初步研究。為了更好地了解朝倉花椒生理生化各方面的分子調(diào)控機(jī)制，實(shí)驗(yàn)室前期通過測序，成功構(gòu)建了朝倉花椒的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，并對(duì)朝倉花椒的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析[17]，利用朝倉花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫提供的序列信息設(shè)計(jì)引物對(duì)朝倉花椒幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行克隆分析[18]，對(duì)朝倉花椒編碼氨基酸基因序列進(jìn)行密碼子偏好性分析[19]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究通過BLAST比對(duì)，成功從朝倉花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定獲得31個(gè)CBL基因，并對(duì)該基因家族的所有基因就其保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系、亞組分類等方面進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為朝倉花椒品種培育以及對(duì)朝倉花椒生長發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)錄組序列測定材料為樹齡6年的朝倉花椒(采自貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院種植基地)，采用E.Z.N.ATM Plant RNA提取試劑盒(O MEGA bio-tek Inc.,Norcross,GA,USA)進(jìn)行總RNA提取并委托深圳華大基因公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1朝倉花椒CBL基因家族的鑒定

通過NCBI BLAST分析，去除重復(fù)，從朝倉花椒轉(zhuǎn)錄組中鑒定獲得31條ZpCBL家族的編碼基因序列。

1.2.2朝倉花椒CBL蛋白基本性質(zhì)鑒定

鑒定出朝倉花椒CBL基因家族成員后利用在線軟件ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)所有朝倉花椒CBL蛋白氨基酸序列進(jìn)行分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、親疏水性預(yù)測[20]。

1.2.3朝倉花椒CBL基因家族進(jìn)化關(guān)系分析

為探究朝倉花椒CBL基因家族進(jìn)化關(guān)系，從相應(yīng)網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載擬南芥、橙子、楊樹的CBL蛋白氨基酸序列與朝倉花椒CBL蛋白序列進(jìn)行了一個(gè)合并的系統(tǒng)進(jìn)化分析，利用MEGA軟件，采用鄰接法 (Neighbor-Joining)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[21]。

1.2.4朝倉花椒CBL蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)在線工具對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測[22]、使用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測[23]。

1.2.5朝倉花椒CBL家族蛋白多序列對(duì)比和保守基序分析

使用DNAMAN序列分析軟件對(duì)篩選得到的31條朝倉花椒的CBL氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。在線分析軟件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)定位各條ZpCBL蛋白序列的保守基序。

2 結(jié)果與分析

2.1 朝倉花椒CBL基因家族的鑒定

利用生物信息學(xué)方法，從朝倉花椒轉(zhuǎn)錄組中鑒定獲得31條CBL家族的編碼基因序列, 將其命名為ZpCBL1～ZpCBL31(表1)。通過ProtParam在線工具，對(duì)朝倉花椒CBL基因家族進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，31條ZpCBL基因編碼長度范圍為108～858 bp，其中ZpCBL27的序列最短，為108 bp,近編碼35個(gè)氨基酸，其編碼蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量大小僅3.98 kDa，而ZpCBL5的序列最長，為858 bp, 共編碼285個(gè)氨基酸，其編碼蛋白分子量為32.92 kDa。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，ZpCBL家族蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)范圍在4.32～5.03之間，整體偏酸性。其中共19條ZpCBL蛋白不穩(wěn)定系數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白。ZpCBL蛋白中，除ZpCBL 1、ZpCBL 9、ZpCBL 10及ZpCBL 27為疏水蛋白外，其余均為親水蛋白。

表1 朝倉花椒CBL基因家族基本性質(zhì)

2.2 朝倉花椒CBL 蛋白進(jìn)化關(guān)系分析

為深入分析與其他物種的同源進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了朝倉花椒、擬南芥、楊樹、橙子的CBL基因蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，65個(gè)CBLs蛋白根據(jù)進(jìn)化樹的分枝，可分為4個(gè)組(Ⅰ～Ⅳ)，Ⅰ組16個(gè)：ZpCBL 3、ZpCBL 9、ZpCBL 10、ZpCBL 16、ZpCBL 17、ZpCBL 18、ZpCBL 19、ZpCBL 20、ZpCBL 21、ZpCBL 22、ZpCBL 24、ZpCBL 25、ZpCBL 27、ZpCBL 28、ZpCBL 30、ZpCBL 31；Ⅱ組8個(gè)：ZpCBL 4、ZpCBL 5、ZpCBL 6、ZpCB 7、ZpCBL 13、ZpCBL 23、ZpCBL 26、ZpCBL 29；Ⅲ組5個(gè)：ZpCBL 1、ZpCBL 2、ZpCBL 11、ZpCBL 12、ZpCBL 15；Ⅳ組2個(gè)成員：ZpCBL 14、ZpCBL 8(圖1)。

注：擬南芥(Arabidopsis thaliana)：AtCBL 1～13；橙子(Citrus sinensis)：CsCBL 1～8；楊樹(Populus trichocarpa)：PtCBL 1～13。圖1 植物CBL蛋白進(jìn)化樹

2.3 朝倉花椒CBL蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

為進(jìn)一步研究ZpCBL蛋白空間結(jié)構(gòu)上的相似性，對(duì)ZpCBL家族蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(表2)。ZpCBL蛋白α螺旋比例較高，在36.07%～62.50%之間，β折疊比例為3.28%～10.14%，延伸鏈比例為3.41%～19.80%，無規(guī)則卷曲比例在21.78%～47.54%之間。對(duì)ZpCBL蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)相似(圖2)。對(duì)空間結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)ZpCBL蛋白為多鏈折疊蛋白，以α螺旋為主。

2.4 朝倉CBL家族蛋白多序列對(duì)比

利用DNAMAN軟件對(duì)篩選得到的31條朝倉花椒CBL蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)朝倉花椒CBL家族EF-hand結(jié)構(gòu)域具有較高保守性，多個(gè)氨基酸位點(diǎn)保守不變(圖3)。

2.5 朝倉花椒CBL家族蛋白結(jié)保守基序分析

使用在線軟件MEME對(duì)保守基序進(jìn)行預(yù)測分析，再一次證明了EF-hand結(jié)構(gòu)域是高度保守的。其中超過一半以上的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域序列擁有6種保守基序(圖4)。

3 討 論

鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白(Calcineurin B-like protein，CBL)是植物所特有的一類鈣信號(hào)感受器，其通過結(jié)Ca2+被激活后以磷酸化的方式激活下游的鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinases，CIPKs)，激活的CIPKs迅速通過磷酸化下游信號(hào)分子傳遞鈣離子信號(hào)[24]。在高等植物中，參與特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、感受并響應(yīng)鈣濃度變化是CBL蛋白家族作為Ca2+傳感蛋白的基本功能。近年來，隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)的進(jìn)一步完善，基于轉(zhuǎn)錄組或基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因家族鑒定的報(bào)道日益增多，張杰偉等研究發(fā)現(xiàn)，桃基因組中的8個(gè)CBL家族基因，分布于桃的5條染色體上[24]。桃PpCBLs均含有保守的EF結(jié)構(gòu)域，可分為4個(gè)亞家族。桃PpCBLs存在著大量的絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸潛在磷酸化位點(diǎn)；PpCBL 2、PpCBL 3和PpCBL 5均含有1個(gè)N-豆蔻酰化位點(diǎn)；PpCBL 1含有1個(gè)跨膜區(qū)[24]。劉淑梅等[25]從番茄基因組中鑒定出13個(gè)CBL基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，番茄CBL基因在基因組中的分布是不均勻的，外顯子數(shù)大多為8或者9，編碼區(qū)序列大小在561～774 bp之間，但未對(duì)朝倉花椒CBL基因家族進(jìn)行鑒定。本研究鑒定朝倉花椒CBL基因家族含有31個(gè)成員，并分別命名為ZpCBL1-31。EF-hand結(jié)構(gòu)域是CBL蛋白的典型結(jié)構(gòu)域。Kolukisaoglu等研究表明，不同的CBL蛋白的EF-hand結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變異，但在所有已知的CBL蛋白中，EF-hand結(jié)構(gòu)域的個(gè)數(shù)以及它們之間的距離是保持不變的[13]。結(jié)構(gòu)域分析表明，31個(gè)朝倉花椒ZpCBL都含有4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域，它們之間的距離非常保守，隨著各個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域的分離以及生物學(xué)功能的解析，進(jìn)一步豐富人們對(duì)植物CBL生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)。對(duì)ZpCBL基因家族進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，朝倉花椒與擬南芥、橙子、楊樹CBL蛋白在各亞家族之間均有成員分布。ZpCBL基因家族在進(jìn)化上可分為4組，第Ⅰ組16個(gè)、第Ⅱ組8個(gè)、第Ⅲ組5個(gè)、第Ⅳ組2個(gè)成員，根據(jù)彭昭雯[26]研究的CBL基因家族分類可知，第Ⅰ組屬于第一亞家族和第二亞家族，第Ⅱ組屬于第一亞家族，第Ⅲ組屬于三四亞家族，第Ⅳ組屬于第二亞家族。第二亞家族中擬南芥AtCBL 1與AtCBL 9序列一致性高達(dá)89.00%，但是其功能卻存在異同，表明有一定功能冗余[27,28], 擬南芥AtCBL1能被高鹽、干旱、低溫和傷害等非生物脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，但不受外源ABA脅迫的影響[29]，而擬南芥AtCBL9則能被ABA脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[28]；推測第Ⅳ組中的ZpCBL14、ZpCBL8基因可能響應(yīng)高鹽、干旱、低溫等脅迫誘導(dǎo)，但其具體響應(yīng)何種脅迫還需要進(jìn)一步研究其在植物體內(nèi)功能。本研究以朝倉花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)ZpCBL基因家族進(jìn)行了初步的分析鑒定，為進(jìn)一步研究ZpCBL基因蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系以及作用機(jī)理提供重要依據(jù)。

表2 ZpCBL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和比例

圖2 ZpCBL蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

圖3 ZpCBL蛋白結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)

圖4 ZpCBL序列Logo及保守基序