(貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室/生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽 550025)

鉀是植物生長發(fā)育所必需的大量元素，不僅可參與植物細(xì)胞滲透勢調(diào)節(jié)，還能介導(dǎo)植物體中多種重要的生理功能[1]，如K可作為植物細(xì)胞內(nèi)多種酶的催化劑，調(diào)控氣孔開閉、控制生物大分子合成分解、調(diào)節(jié)光合作用強(qiáng)弱、影響植物對逆境脅迫能力抗性的高低等[2,3]。另外，鉀含量的高低同樣決定著農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)，在煙草中K被認(rèn)為是評判煙葉品質(zhì)優(yōu)劣的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[4]。植物在長期進(jìn)化過程中形成了一系列復(fù)雜的K+吸收和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。如擬南芥(Arabidopsisthaliana)中存在15個K+選擇性通道，包括9個Shaker型、5個TPK(two-pore K+channel)型和1個Kir-like型K+通道[5-7]。AKT 1屬Shaker型K+通道，是植物中廣泛存在的一種內(nèi)向整流K+通道[8]。Sentenac等利用酵母雙突變體互補(bǔ)法從A.thaliana中克隆出第一個高等植物的Shaker型K+通道基因AtAKT1，該基因位于擬南芥第2號染色體上，含有11個外顯子和10個內(nèi)含子，編碼857個氨基酸(amino acid，AA)殘基組成的多肽。之后，研究者先后從馬鈴薯(Solanum tuberosum)[9]、玉米(Zeamays)[10]、小麥(Triticumaestivum)[11]、大麥(Hordeumvulgare)[12]、葡萄(Vitisvinifera)[13]和鹽地堿蓬(Suaedasalsa)[14]等植物中分離出AKT1基因。對植物AKT 1編碼蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，AKT 1蛋白含有6個跨膜片段(S1～S6)，其中第4個跨膜片段S4含有大量帶正電荷的AA殘基，主要作為電壓感受器參與響應(yīng)膜電勢的變化，調(diào)節(jié)其在膜上移動改變AKT 1的構(gòu)象，實現(xiàn)該通道孔的開啟與關(guān)閉[15,16]。S5和S6之間含有1個高度保守的P環(huán)結(jié)構(gòu)域，陷入細(xì)胞膜內(nèi)構(gòu)成一個通道孔(圖1)。

圖1 植物Shaker型K+通道拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示意圖

同時，AKT 1具有Shaker型K+通道中典型的TxGYG(Thr-XGly-Tyr-Gly)序列，該結(jié)構(gòu)為K+選擇器。AKT 1胞質(zhì)端(C端)從第6個跨膜片段末尾起，含有1個C接頭(約80個AA殘基)，1個環(huán)核苷酸結(jié)合域(cyclic-nucleotide binding domain，CNBD)，1個錨蛋白域(anchor protein domain，APD)和1個富含疏水性、酸性殘基的KHA域[16]。在大多數(shù)Shaker型K+通道家族成員中，APD可促進(jìn)通道與細(xì)胞骨架連接、蛋白質(zhì)相互和胞質(zhì)的調(diào)節(jié)等[17,18]。此外，AKT 1在植物逆境脅迫響應(yīng)中也發(fā)揮了重要作用，如介導(dǎo)植物的K+饑餓耐受性[19]、耐鹽性[20]及抗旱性等。因此，為了解煙草中AKT1基因的結(jié)構(gòu)和功能，本研究以林煙草(N.sylvestris)為材料，利用同源克隆技術(shù)克隆NsAKT1、分析該基因的結(jié)構(gòu)特征；同時，對NsAKT 1蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，為進(jìn)一步研究AKT1在N.sylvestris中的功能和作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

林煙草(N.sylvestris)植株、大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)菌株DH 5 α均由貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院保存并提供。選取生長良好、萌發(fā)至6～8葉期的林煙草幼苗為實驗材料?？寺≥d體pGEM-T Easy Vector Systems購于Promega公司；膠回收試劑盒購自Invitrogen Ambion公司；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase，DNA 5000 bp Marker，T4DNA ligase和DNA 2000 bp Marker購于Takara公司；Plant RNA Kit購于Bio-Tek OMEGA公司，MultiScribeTMReverse Transcriptase Kit均購自Applied Biosystems 公司；GelRedTM10000×購于BIOTIUM公司；X-Gal、IPTG、氨芐青霉素(ampicillin，AMP)均購于Sigma-Aldich公司。NsAKT1克隆引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1煙草cDNA制備及NsAKT1克隆

以6～8葉期林煙草幼嫩葉片為材料，參照Plant RNA Kit操作說明提取煙草的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR反應(yīng)體系(20.0 μL)：25×dNTP Mix(100 mmol·L-1)0.8 μL，10×RT Buffer 2.0 μL，10×RT Random Primers 2.0 μL，RNA inhibitor 1.0 μL，MultiScribeTMReverse Transcriptase 1.0 μL，Nucleasefree H2O 3.2 μL，RNA template 10.0 μL。反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min；37 ℃ 120 min；85 ℃ 5 min；4 ℃保持。以cDNA為模板，以特異性引物AKT 1-F(5′-ATGGGAGATGTGAGAAGAAATAATAATTTTGG-3′)和AKT 1-R(5′- TCACCTCAACTCATCACCTTCTGATG-3′)，PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳分離檢測，比較不同處理及對照樣品中條帶亮度的相對強(qiáng)弱。

圖3 煙草AKT 1蛋白信號肽預(yù)測

1.2.2目標(biāo)片段連接及測序

參照膠回收試劑盒說明，將PCR擴(kuò)增的亮條帶切割后回收DNA，回收的DNA片段參照Promega公司pGEM-T Easy Vector Systems試劑盒操作將此DNA片段通過T4DNA連入T載體后，導(dǎo)入E.coli感受態(tài)菌株DH 5 α，通過藍(lán)白斑篩選陽性克隆菌落，菌落送由深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN對蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行分析；ProtParam對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測；利用ProtScale(http://web.expasy.org/ProScale)對蛋白質(zhì)疏水性進(jìn)行分析；SignalP 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)進(jìn)行信號肽預(yù)測；TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行蛋白跨膜螺旋分析；PSORT WWW Server(https://psort.hgc.jp/)進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析；SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html)對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；以SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模；利用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對蛋白質(zhì)磷酸化位點進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NsAKT 1基因克隆及測序

通過同源克隆，從N.sylvestris擴(kuò)增出1條大于2 000 bp的亮帶，該片段依次經(jīng)電泳、回收、T載體連接和大腸桿菌導(dǎo)入后送由華大基因科技有限公司測序。利用DNAMAN對測序結(jié)果進(jìn)行拼接、連接，得到全長為2 682 bp的基因序列。通過NCBI比對，克隆片段基因與普通煙草(N.tabacum)和絨毛煙草(N.tomentosiformis)類AKT 1通道蛋白基因(FJ 233071.1和XM_009621194.3)、寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)KT 1通道蛋白基因(KU 523244.1)、黑枸杞(Lyciumruthenicum)AKT 1通道蛋白基因(KY 465774.1)、番茄(Solanumlycopersicum)LKT 1通道蛋白基因(NM_001247329.3)分別有100%、100%、98%、98%和98%的序列一致度。說明利用同源克隆，從林煙草中得到了NsAKT1基因，且該基因在相同物種中保守性較高。

注：M為DNA 2 000 bp Marker；N為Negative control；P為Positive control；S為Sample。 圖2 目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增

2.2 NsAKT 1基因編碼序列分析

用DNAMAN對NsAKT1基因進(jìn)行分析，得到NsAKT 1蛋白序列。分析后可知：煙草AKT1基因開放閱讀框長度為2 682 bp，編碼893個AA，分子量為100.375 kDa。帶電荷氨基酸217個，占24.3%；堿性氨基酸100個，占11.2%；酸性氨基酸117個，占13.1%；極性氨基酸234個，占26.2%；疏水性氨基酸47個，占5.2%。含量最多的是亮氨酸(Leu)，達(dá)到12.2%，含量最少的是色氨酸(Trp)，只占1.2%。該蛋白等電點為6.54，負(fù)電殘基(Asp+Glu)有100個，正電殘基(Arg+Lys)有95個，原子總數(shù)14 103，分子式簡寫為C4500H7083N1241O1307S32。脂肪族系數(shù)為97.25，不穩(wěn)定指數(shù)為34.76，總平均親水性-0.104。

注：Ser為色氨酸；Thr為蘇氨酸；Tyr為絡(luò)氨酸。 圖4 AKT 1磷酸化位點預(yù)測位置

2.3 NsAKT 1蛋白親疏水性分析及信號肽預(yù)測

利用在線分析軟件ProScale(http://web.expasy.org/ProScale)對AKT 1蛋白的親疏水性進(jìn)行分析。已知，疏水性代表正值，親水性代表負(fù)值。分析可知，數(shù)值超過2的有5個峰值，分別在75～76位，115位，210位，425位及579位，最大值為2.956；數(shù)值低于-2的有11個峰值，較為突出的4個峰值分別在66位，560位，768位及881位，最小值為-3.233。根據(jù)以上分析判斷，該蛋白是一個親水性蛋白。同時，利用在線分析軟件SignalP 4.0預(yù)測蛋白信號肽表明，煙草AKT 1蛋白信號肽分析(圖3)，C-max位點為22，C-score≒0.116；Y-max位點為4，Y-score≒0.143；S-max位點為20，S-score≒0.200；D≒0.169；SP≒‘NO’，說明煙草AKT 1蛋白沒有信號肽，不是分泌性蛋白。

2.4 NsAKT 1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用在線分析軟件TMpred Server對林煙草AKT 1 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示有6個跨膜區(qū)域，如圖6。第1個跨膜區(qū)域，從第71位氨基酸到第91位氨基酸，長度為21個氨基酸，方向為o-i；第2個跨膜區(qū)域，從第104位氨基酸到第122位氨基酸，長度為19個氨基酸，方向為i-o；第3個跨膜區(qū)域，從第206位氨基酸到225位氨基酸，長度為20個氨基酸，方向為o-i；第4個跨膜區(qū)域，從第249位氨基酸到第269位氨基酸，長度為21，方向為o-i；第5個跨膜區(qū)域，從第283位氨基酸到第305位氨基酸，長度為23，方向為o-i；第6位跨膜區(qū)域，從第568位氨基酸到第586位氨基酸，長度為19，方向為i-o。利用在線分析軟件TMHMM Server v. 2.0對其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，進(jìn)一步確認(rèn)煙草AKT 1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域有6個。

注：h為α螺旋；t為β折疊；c為β轉(zhuǎn)角；e為無規(guī)卷曲。 圖5 AKT 1二級結(jié)構(gòu)各組成位置及空間構(gòu)型預(yù)測

2.5 NsAKT 1蛋白亞細(xì)胞定位及磷酸化位點預(yù)測

利用在線分析軟件PSORT WWW Server對該蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測可知，AKT 1蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(0.685)、質(zhì)膜(0.640)、高爾基體(0.460)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(0.100)。利用在線預(yù)測軟件NetPhos 3.1 Server 對AKT 1蛋白的磷酸化位點進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如下(圖4)，已知閾值大于0.5證明該位點磷酸化，絲氨酸(S)磷酸化位點有40個，蘇氨酸(T)磷酸化位點有24個，酪氨酸(Y)磷酸化位點有3個。

2.6 NsAKT 1蛋白二級與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線分析軟件SOPMA預(yù)測林煙草AKT1編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果(圖5)顯示，目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，40.6%氨基酸殘基組成α螺旋、15.6%氨基酸殘基組成延伸鏈、7.2%氨基酸殘基組成β轉(zhuǎn)角以及36.6%氨基酸殘基組成無規(guī)卷曲。其中363個氨基酸殘基組成48個α螺旋(α-helix)、139個氨基酸殘基組成35個延伸鏈(extended strand)、64個氨基酸殘基組成36個β轉(zhuǎn)角(β-turn)及327個氨基酸殘基組成59個無規(guī)則卷曲(random coil)。無規(guī)則卷曲將前三者連接起來。利用在線分析軟件SWISS-MODEL對目的蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)同源建模(圖6)。

圖6 AKT 1三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型

3 討 論

鉀(K)是植物生長發(fā)育必需的大量營養(yǎng)元素之一，主要通過根細(xì)胞的K+通道及轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)吸收。AKT 1是Shaker型K+通道家族的重要成員，在植物根吸收K+和體內(nèi)跨膜轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用。本研究以林煙草(N.sylvestris)為材料，利用同源克隆方法從中擴(kuò)增得到全長NsAKT1基因。核酸序列分析表明，該基因長度為2 682 bp，可編碼893個AA的蛋白，與擬南芥(A.thaliana)AKT 1編碼857個AA[23]、陸地棉(upland cotton)AKT 1編碼875個AA[24]有一定長度差異，暗示AKT 1通道蛋白的大小在遠(yuǎn)緣物種中表現(xiàn)出一定氨基酸數(shù)目的差異，同時也存在物種間的保守性。進(jìn)一步對NsAKT1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽及親疏水性預(yù)測發(fā)現(xiàn)，林煙草鉀離子通道AKT 1蛋白含有6個跨膜區(qū)域，不含信號肽，為親水性蛋白。王英琪等[22]研究大豆(Glycinemax)AKT 1時也提出，大豆GmAKT 1通道蛋白有5個跨膜區(qū)域，為親水性蛋白，在根部表達(dá)量最高，這說明GmAKT 1在大豆鉀離子吸收中有重要作用。本研究利用TMHMM及Tmpred軟件預(yù)測了NsAKT 1的跨膜結(jié)構(gòu)域，使用TMHMM的預(yù)測結(jié)果與王英琪等[22]預(yù)測GmAKT 1結(jié)果相一致，大豆和林煙草的NsAKT 1均為5個跨膜結(jié)構(gòu)域；但Tmpred預(yù)測結(jié)果表明，NsAKT 1為6個跨膜結(jié)構(gòu)域，推測2種軟件在對氨基酸序列進(jìn)行計算時存在一定的閾值范圍，故而導(dǎo)致分析的結(jié)果有一定的差異。但兩種軟件都預(yù)測到了NsAKT 1具有的前5個跨膜結(jié)構(gòu)域，暗示林煙草AKT 1至少由5個跨膜結(jié)構(gòu)域組成。

通過對NsAKT 1氨基酸理化性質(zhì)分析表明，脂肪族系數(shù)為97.25，不穩(wěn)定指數(shù)為34.76，總平均親水性-0.104，酸性氨基酸有117個，堿性氨基酸有100個，理論等電點為6.54，負(fù)電殘基(Asp + Glu)有100個，正電殘基(Arg + Lys)有95個，結(jié)合吳畢莎等[25]研究蛋白質(zhì)酸堿性的判斷方法，推斷NsAKT 1為一個酸性蛋白。蛋白質(zhì)親疏水性預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白最大數(shù)值為2.956，最小數(shù)值為-3.233，正值超過2的有5個峰值，低于-2的有11個峰值，總體分析后得出該蛋白為親水性蛋白，與Dennison等[26]的研究結(jié)果相一致。在蛋白質(zhì)磷酸化位點分析中，預(yù)測色氨酸(tryptophan，Trp)、蘇氨酸(threonine，Thr)及絡(luò)氨酸(tyrosine，Tyr)磷酸化位點各40、24、3個。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，林煙草AKT 1基因編碼的蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體等部位。進(jìn)一步對NsAKT的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測，得到該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由48個α螺旋(α-helix)、35個延伸鏈(extended strand)、36個β轉(zhuǎn)角(β-turn)及59個無規(guī)則卷曲(random coil)組成，而無規(guī)則卷曲將前三者連接起來。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究N.sylvestris中AKT1基因功能提供了理論依據(jù)。