陳德榮 張曉云 王秀珍 任婷遠(yuǎn) 王榮德

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)常發(fā)生于口腔黏膜，是惡性程度較高且容易轉(zhuǎn)移的鱗狀細(xì)胞癌[1]。由于其發(fā)展迅猛且對于常規(guī)療法不敏感，導(dǎo)致患者的生存率較低，嚴(yán)重威脅著人們的生命和健康[2]。紫杉醇(PTX)是作用于細(xì)胞微管的抗腫瘤藥物，對OSCC有明顯療效，但PTX存在毒副作用較強且容易產(chǎn)生耐藥性的問題[3-4]。研究表明，使用PTX單藥治療不如聯(lián)合用藥的療效顯著。目前聯(lián)合用藥方案已經(jīng)廣泛運用于多種惡性腫瘤治療，中藥作為新型化療佐劑，在提高腫瘤化療水平和減輕化療副作用方面受到關(guān)注[5-6]。橙皮苷(hesperidin，HES)是天然的黃酮類化合物，具有抗老化、抗炎、提高免疫力及神經(jīng)保護(hù)的作用，能夠誘導(dǎo)肝癌，乳腺癌，肺癌及胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[7-9]，具有良好的抗癌活性，其對口腔鱗狀細(xì)胞的作用尚不明確，本文從體內(nèi)外實驗檢測其對OSCC的作用及其和PTX聯(lián)合使用后的效果。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和動物分組

人口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞(南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實驗室)；SPF級BALB/c雌性裸鼠(18～20 g，5～6 周齡)(許可證號: SCXK 2017-0022，上海斯萊克實驗動物有限公司)。裸鼠飼養(yǎng)在SPF級實驗動物中心，飼養(yǎng)溫度為23～26 ℃，濕度為35%。分為空白組，HES組,PTX組，二倍紫杉醇(2×PTX組)和HES+PTX組，每組5 只。分別用生理鹽水，10 mg/kg HES，10 mg/kg PTX，20 mg/kg PTX和10 mg/kg HES+10 mg/kg PTX處理，經(jīng)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

橙皮苷(CAS: 520-26-3，純度≥98%)(成都瑞芬思生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司,美國)；胰蛋白酶-EDTA細(xì)胞消化液(TE)、FBS 胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)；一抗和二抗均(Santa公司,美國)；原位末端標(biāo)記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)；CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒及ECL發(fā)光試劑盒(北京碧云天生物科技有限公司)。

ML-dr3518酶標(biāo)分析儀(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；CytoFLEX流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特有限公司,美國)；Western blot電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司,美國)；裸鼠飼養(yǎng)籠設(shè)備(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 CCK-8檢測增殖抑制情況 將Tca8113細(xì)胞以1×104/孔接種至96 孔板中并放入培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞滿度約為70%后換液處理，用1% FBS的DMEM孵育2 h，隨后分成8 個濃度組：空白組，(5、10、15、20 μmol/L)HES，10 μmol/L PTX，20 μmol/L PTX及10 μmol/L HES+20 μmol/L PTX。處理24 h后，加入15 μl CCK-8溶液，利用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測量吸光度值，實驗重復(fù)3 次并計算細(xì)胞存活率。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)法檢測細(xì)胞凋亡情況 將Tca8113細(xì)胞接種至6 孔板，過夜培養(yǎng)。按空白組，10 μmol/L HES，20 μmol/L HES，10 μmol/L PTX，20 μmol/L PTX及10 μmol/L HES+10 μmol/L PTX處理。隨后收集細(xì)胞于Tube管中，5 000 r/min離心4～5 min，舍去上層清液，每管中加入95 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入3 μl Annexin V-FITC和2 μl PI染料，并設(shè)置單色對照組空白對照組，利用流式細(xì)胞儀對凋亡的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.3 Transwell法檢測細(xì)胞遷移情況 將Tca8113細(xì)胞消化離心重懸，調(diào)整濃度為5×106個/ml，取200 μl加到小室的上層。下層加入500 μl含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)液，擦去小室上層沒有侵襲或遷移的細(xì)胞。PBS沖洗2 次，4%多聚甲醛固定15 min。然后用0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色0.5 h。放大400 倍隨機(jī)觀察5 個視野，計數(shù)遷移至小室微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)，并定量分析。

1.3.4 構(gòu)建裸鼠移植瘤模型及分組藥物處理 將Tca8113細(xì)胞密度調(diào)整至2×107/ml，以每只裸鼠5×106個細(xì)胞皮下接種，注射器針管要插在裸鼠背部右側(cè)靠近腋窩處，注入細(xì)胞后用指肚輕輕按壓注射的位置，每天觀察裸鼠及腫瘤狀況。當(dāng)接種裸鼠均出現(xiàn)直徑大5 mm3的皮下質(zhì)硬結(jié)節(jié)時，根據(jù)分組的實驗方案，隔天灌胃給藥1 次，持續(xù)4 周，實驗中各組裸鼠未出現(xiàn)死亡情況。停藥后，犧牲裸鼠，剝離腫瘤。

1.3.5 對裸鼠瘤小鼠腫瘤體積及重量的測定 每3 天用游標(biāo)卡尺對瘤體的體積進(jìn)行測量，計算公式為V=1/2×長徑×短徑2；待實驗結(jié)束犧牲小鼠后，完整剝離腫瘤，記錄瘤體最終的質(zhì)量；計算腫瘤抑制率=(空白對照組瘤重均值-實驗組瘤重均值)/空白組對照瘤重均值×100%。

1.3.6 TUNEL法檢測各組腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡情況 將裸鼠的腫瘤組織固定、石蠟包埋，以4 μm為厚度進(jìn)行連續(xù)切片，隨后根據(jù)TUNEL檢測試劑盒說明書操作，對腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測。在400倍的光學(xué)顯微鏡下觀察計數(shù)，計算細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)。

1.3.7 Western blotting檢測腫瘤組織細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白變化 取移植瘤組織，用超聲波破碎儀破碎，在4 ℃離心機(jī)中以14 000×g離心30 min，取上清蛋白，BCA法測蛋白含量，配置10%～15%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，隨后轉(zhuǎn)移至NC膜上，脫脂乳封閉2 h，一抗4 ℃水平搖床孵育過夜，TBST洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，再通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。內(nèi)參選擇GAPDH，并利用Image J軟件對所出條帶進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8實驗檢測Tca8113細(xì)胞的增殖情況

HES以濃度依賴性方式抑制Tca8113細(xì)胞的增殖，IC50為10.68 μmol/L；在10 μmol/L濃度下，HES的增殖抑制作用等同PTX；在聯(lián)合處理組中，Tca8113細(xì)胞的存活率進(jìn)一步降低為16.38%±1.24%，在20 μmol/L PTX和20 μmol/L HES處理組中，Tca8113細(xì)胞的存活率分別為28.73%±3.64%和30.28%±1.52%，與10 μmol/L HES+10 μmol/L PTX相比具有顯著性差異(表 1)。

2.2 HES聯(lián)合PTX對OSCC的誘導(dǎo)凋亡作用

HES和PTX均具有較好的誘導(dǎo)凋亡能力且PTX略優(yōu)于HES；10 μmol/L HES+10 μmol/L PTX聯(lián)合處理時，凋亡細(xì)胞比例達(dá)到83.68%，高于2 種藥物分別以20 μmol/L處理時對細(xì)胞產(chǎn)生的誘導(dǎo)凋亡效果，具有顯著性差異(表 1)。

2.3 HES聯(lián)合PTX抑制OSCC的遷移及侵襲

10 μmol/L HES和PTX對Tca8113細(xì)胞沒有明顯的遷移抑制能力，但是20 μmol/L HES和PTX能夠在一定程度上抑制細(xì)胞遷移及侵襲，但當(dāng)以10 μmol/L HES+10 μmol/L PTX聯(lián)合處理時，遷移及侵襲的細(xì)胞數(shù)目顯著降低，效果優(yōu)于20 μmol/L PTX，差異具有顯著性(P<0.05)(圖 1)。

表 1 HES聯(lián)合PTX對Tca8113細(xì)胞的增殖抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用

圖 1 HES聯(lián)合PTX對Tca8113細(xì)胞遷移的影響

2.4 HES聯(lián)合PTX對OSCC裸鼠移植瘤的抑制作用

HES+PTX組的瘤體體積始終低于2×PTX組，處在各組最低(圖 2)；HES組、PTX組、2×PTX組和HES+PTX組的瘤體質(zhì)量和腫瘤抑制率均低于對照組，且HES+PTX組腫瘤抑制率高于HES組、PTX組、2×PTX組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表 2)。

圖 2 橙皮苷聯(lián)合紫杉醇對裸鼠移植瘤體積的影響

2.5 HES聯(lián)合PTX對裸鼠移植瘤組織的病理形態(tài)特征的影響

HE染色結(jié)果可以看出對照組腫瘤細(xì)胞豐富，排列密集，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的比例較大；HES組、PTX組、2×PTX組和HES+PTX組的腫瘤細(xì)胞數(shù)目減少，排列稀疏，大部分細(xì)胞胞漿透明成空泡狀，可見凋亡小體及大范圍壞死區(qū)(圖 3)。

表 2 HES聯(lián)合PTX對裸鼠移植瘤重量的影響及腫瘤抑制率

圖 3 HES聯(lián)合PTX對裸鼠移植瘤瘤體組織病理形態(tài)影響

2.6 HES聯(lián)合PTX對OSCC裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡的影響

空白對照組腫瘤組織凋亡細(xì)胞很少，而在實驗組中，HES組、PTX組、2×PTX組和HES+PTX組的黃棕色細(xì)胞數(shù)量較對照組增加，且HES+PTX組凋亡數(shù)量最多，較HES組、PTX組、2×PTX組的凋亡細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖 4)。

2.7 HES聯(lián)合PTX對OSCC裸鼠移植瘤凋亡及遷移蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果如圖 5，凋亡蛋白中，HES組、2×PTX組和HES+PTX組的裸鼠移植瘤組織中Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯降低，與空白組比較，差異有顯著性(P<0.05)，同時這幾種蛋白在HES+PTX組較HES組和2×PTX的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在細(xì)胞遷移蛋白中，HES+PTX組的裸鼠移植瘤組織中MMP-9，N-cadherin及snail蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)升高，與空白對照，HES組及2×PTX組相比具有顯著性差異。

3 討 論

化學(xué)治療的不斷深入及多種化療藥物的開發(fā)及應(yīng)用，使其在OSCC發(fā)揮著越來越重要的作用[10-11]。不同的藥物聯(lián)合使用，不僅可以減少部分不良反應(yīng)較大藥物的用量，同時也可以達(dá)到更好的效果[12]。中藥提取物近年來在多種疾病上的應(yīng)用和取得的療效已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可[13]。HES從中藥橙皮中提取出，被證實具有抗老化、抗炎、提高免疫力及神經(jīng)保護(hù)的作用并能夠?qū)追N消化道癌癥起到抑制增殖的作用。本研究證實HES對OSCC具有增殖抑制作用，當(dāng)聯(lián)合PTX后，對細(xì)胞的增殖抑制率高達(dá)16.38%±1.24%。為了驗證兩者共同使用引起的增殖抑制作用是協(xié)同作用還是疊加作用，檢測20 μmol/L PTX組細(xì)胞存活率，可看出10 μmol/L HES+10 μmol/L PTX對細(xì)胞的增殖抑制效果要強于20 μmol/L PTX，證明了HES能夠協(xié)同PTX增強對OSCC的增殖抑制作用。利用流式細(xì)胞術(shù)和Transwell實驗檢測細(xì)胞凋亡情況和遷移情況，可以看出當(dāng)以10 μmol/L HES+10 μmol/L PTX聯(lián)合處理時，凋亡細(xì)胞比例達(dá)到83.68%，遷移細(xì)胞數(shù)量比例降低65%，顯著優(yōu)于2 種藥物分別以20 μmol/L 處理時對細(xì)胞產(chǎn)生的效果，說明兩種藥物聯(lián)用具有較好的協(xié)同作用。

圖 4 HES聯(lián)合PTX對裸鼠移植瘤瘤體組織細(xì)胞凋亡的影響

圖 5 HES聯(lián)合PTX對OSCC裸鼠移植瘤細(xì)胞中凋亡及遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

體內(nèi)實驗是驗證藥效的關(guān)鍵步驟，有研究表明10 mg/kg的PTX對瘤體的生長抑制率為50%左右，因此本研究同樣選取了10 mg/kg的PTX為對照濃度。此前有研究證明HES具有體內(nèi)抗癌活性的同時認(rèn)為HES的處理濃度在10～15 mg/kg，為研究HES及PTX聯(lián)合使用的抗癌效果，將HES的處理濃度定為10 mg/kg。結(jié)果顯示10 mg/kg HES+10 mg/kg PTX對裸鼠瘤體的體積和質(zhì)量的抑制程度進(jìn)一步加大，腫瘤抑制率為66.17%，顯著優(yōu)于20 mg/kg PTX組。HE染色和TUNEL實驗檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，HES+PTX組凋亡數(shù)量最多達(dá)到78.38%，較HES組、PTX組、2×PTX組的凋亡細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通過對瘤體組織蛋白表達(dá)檢測結(jié)果顯示，2×PTX組和HES+PTX組的裸鼠移植瘤組織中Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯降低，但是HES+PTX組的變化程度要大于2×PTX組，兩組之間的差異有顯著性(P<0.05)，說明HES聯(lián)合PTX后能夠提高對腫瘤的誘導(dǎo)凋亡能力。

體外實驗已從細(xì)胞層面上證明HES和PTX聯(lián)用對Tca8113細(xì)胞具有較好的抑制遷移及侵襲的作用，在分子水平上檢測遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)中發(fā)現(xiàn)HES處理組和2×PTX處理組的遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)和空白組沒有差異，但HES+PTX組能下調(diào)裸鼠移植瘤組織中MMP-9，N-cadherin及Snail蛋白表達(dá)，上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)，早有研究表示這些蛋白與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移相關(guān)[14-15]，表明PTX和HES聯(lián)用具有抑制細(xì)胞遷移的能力。

綜上所述，HES對和PTX聯(lián)用能夠顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞發(fā)生遷移，可能發(fā)揮協(xié)同抗癌作用，其協(xié)同效應(yīng)值得進(jìn)一步深入研究。