張璇 李祥偉 宋文龍 倪世磊 邱瀅 劉慧敏 李娜

通過牙髓組織工程再生牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體恢復(fù)患牙生理功能的研究具有潛在的臨床應(yīng)用前景。組織工程包括種子細(xì)胞、生長因子和支架三要素。其中，干細(xì)胞具有自我更新和多潛能分化的能力，是組織工程的重要種子細(xì)胞資源[1]。人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cell,hDPSCs)是牙髓組織工程選用的主要種子細(xì)胞。考慮髓腔和根管的解剖特點，選擇方便操作的適宜的支架是牙髓組織工程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。微球是組織工程較常用的載體結(jié)構(gòu)，更好地模擬了體內(nèi)環(huán)境。目前，多種天然及合成材料已被用于牙髓組織再生的研究，如自組裝系統(tǒng)，水凝膠或生物陶瓷等[2]，乳化交聯(lián)法是較常用的微球制備方法。

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是一種非硫酸化的糖胺聚糖，是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要成分，由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸的重復(fù)雙糖組成，由于其獨特的理化性質(zhì)，HA被作為一種保濕因子、潤滑劑和支架材料，具有緩沖壓力、填充劑和擴散屏障、清除自由基和調(diào)節(jié)免疫等多種生理功能[3-4]。細(xì)胞增殖過程中HA的產(chǎn)生增加，該聚合物可能在有絲分裂中發(fā)揮作用[5]。新證據(jù)表明，HA可誘導(dǎo)脂肪源性干細(xì)胞和人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[6-7]。殼聚糖/透明質(zhì)酸納米?？梢园踩行У貙iR-148b轉(zhuǎn)染入大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中[8]。HA在口腔疾病的治療中也得到了廣泛的應(yīng)用[9]。研究表明透明質(zhì)酸聯(lián)合明膠海綿在拔牙中的應(yīng)用在減少術(shù)后出血、感染和腫脹方面有明顯的作用[10]。據(jù)此推測，HA微球有望成為種子細(xì)胞載體應(yīng)用于牙髓組織工程，該研究未見報道。本研究通過乳化交聯(lián)法制備HA微球并進(jìn)行表征，通過微球與牙髓干細(xì)胞共培養(yǎng)和細(xì)胞學(xué)檢測以評價該微球作為細(xì)胞載體的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

透明質(zhì)酸鈉(上海源葉生物科技有限公司，分子量100～150 萬)；己二酸二酰肼(ADH，上海源葉生物科技有限公司)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞酰胺鹽酸鹽(EDC·HCL，上海阿拉丁生物試劑有限公司)；異丙醇、二氯甲烷、司盤80(Span-80)、石蠟(天津市華東試劑廠)；6 mg/ml I型膠原酶、8 mg/ml中性蛋白酶(Sigma Aldrish，美國)；噻唑藍(lán)(MTT,Amresco,美國)；雙抗(PAA，美國)；胰蛋白酶(Hyclone,美國)HDMEM培養(yǎng)液(Gibco,美國)；胎牛血清(Biological Industries,以色列)、恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo，日本)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Jeol，日本)。

1.2 HA微球的制備

1.2.1 HA溶液的配置 將0.25 g的HA溶于49.75 ml的去離子水中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙猓渲?.5%的HA溶液50 ml,封口膜密封，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 HA交聯(lián)微球的制備 將20 ml的石蠟與0.25 ml的Span-80均勻混合作為油相。取5 ml的HA溶液，加入25 mg的ADH攪拌溶解混勻，加入適量稀釋好的0.1 mol/L的HCL水溶液調(diào)節(jié)pH為4～5，油相在中等強度的超聲下，將其逐滴緩慢加入HA溶液中，600 r/min磁力攪拌器下反應(yīng)30 min；將30 mg的EDC·HCL溶于0.5 ml去離子水中，緩慢加入混合液中，室溫下反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，在劇烈的攪拌條件下加入37.5 ml的異丙醇，3 000 r/min的條件下離心5 min，棄上清得到微球沉淀，再用一定量的二氯甲烷洗滌，超聲，棄上清得到微球。將得到的固體在通風(fēng)櫥中靜置干燥。

1.3 HA微球SEM觀察

SEM觀察樣品制樣，將干燥的HA微球粉末均勻分散于粘有導(dǎo)電膠的電鏡樣品臺上，噴金3次，通過SEM觀察微球形貌。

1.4 HA微球的粒徑及粒徑分布

稱取20 mg的HA微球，將其懸浮在2 ml的磷酸鹽緩沖液中，待其在磷酸鹽緩沖液中達(dá)到平衡的狀態(tài)時，使用納米粒度儀測其粒徑分布。

1.5 hDPSCs的分離和培養(yǎng)

1.5.1 hDPSCs的分離與原代培養(yǎng) 實驗選取18～32 歲因阻生拔除的智齒，立刻轉(zhuǎn)移至超凈臺。用含10%雙抗(青霉素-鏈霉素)的HDMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗牙齒表面，酒精棉球擦拭，去除表面可能附著的組織，將牙髓取出后置于1%雙抗的HDMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗2～3 次，剪碎組織塊，1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，棄上清，將6 mg/ml的Ι型膠原酶和8 mg/ml的中性蛋白酶1∶1混合后加入裝有組織塊的聚乙烯管中,37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)消化40 min，每隔10 min彈起混勻，待混懸液呈云絮狀時，即刻加入含20%血清和1%雙抗的培養(yǎng)液終止消化，1 500 r/min離心3 min,將消化好的組織轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，每3 天換液1 次，至顯微鏡下觀察細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶的底部。

1.5.2 hDPSCs形態(tài)觀察 倒置顯微鏡觀察并記錄hDPSCs 在不同時間點的生長狀況及形態(tài)。

1.6 HA微球的消毒及預(yù)處理

用75%乙醇對HA微球消毒30 min，PBS清洗3次，超凈臺內(nèi)紫外照射滅菌3 h，再以含10%胎牛血清及1%雙抗的HDMEM孵育過夜。

1.7 MTT法檢測細(xì)胞毒性

HA微球消毒預(yù)處理，配置含材料的不同濃度梯度的培養(yǎng)基。取第3代hDPSCs,選擇合適的細(xì)胞數(shù)(1 d:4×103個/孔，3 d：1.5×103個/孔)接板于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入含有材料的培養(yǎng)基，實驗組和對照組分別設(shè)置6 個復(fù)孔，于37 ℃，5%CO2孵箱中分別培養(yǎng)1、3 d時，棄去原有培養(yǎng)基，PBS沖洗3 遍，每孔加入含20 μl MTT溶液的培養(yǎng)基200 μl ，按照說明書進(jìn)行操作，測定其在490 nm處的吸光度(A)值。

2 結(jié) 果

2.1 反應(yīng)體系大體觀

石蠟和司盤-80混合均勻，HA溶液緩慢逐滴加入后，整個反應(yīng)體系開始變?yōu)槿闈嵋?圖 1)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，最終可見乳白色均一的混懸液。

2.2 SEM觀察結(jié)果

乳化交聯(lián)的方法制備HA微球，可見微球的形態(tài)規(guī)則，大小均勻一致(圖 2)。粒徑分析儀測定HA微球的平均粒徑為5～10 μm，粒徑分布見圖 3。

2.3 hDPSCs光鏡觀察

從健康人體的第三磨牙中分離出DPSCs群體，原代細(xì)胞(P0)培養(yǎng)15 d，細(xì)胞融合80%左右，細(xì)胞排列緊密，界限不清。待細(xì)胞鋪滿瓶底以1∶3比例進(jìn)行傳代，第一代細(xì)胞(P1)基本為梭形，排列較規(guī)則。總之，hDPSCs顯示出良好的增殖能力，具有間充質(zhì)干細(xì)胞典型的成纖維形態(tài)(圖 4)。

圖 1 反應(yīng)體系大體觀

圖 2 HA微球的掃描電鏡觀察

圖 3 乳化交聯(lián)化學(xué)法制備HA微球的粒徑分布結(jié)果

圖 4 hDPSCs的形態(tài)(×40)

2.4 細(xì)胞毒性檢測結(jié)果

如圖 5，分別為不同濃度梯度的HA微球材料與hDPSCs共培養(yǎng)24、72 h后細(xì)胞的相對增殖率，24、72 h HA微球組的細(xì)胞增殖率均高于空白對照組，并隨著濃度的升高其值也逐漸增加，其中，24 h濃度大于0.4 mg/ml時比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),72 h濃度大于0.2 mg/ml時比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明透明質(zhì)酸微球材料可促進(jìn)hDPSCs的增殖。根據(jù)RGR值, 參照《美國藥典》毒性分級法[11]，各實驗組的細(xì)胞毒性均為0 級，即無細(xì)胞毒性。

圖 5 HA微球細(xì)胞毒性檢測結(jié)果

3 討 論

作為牙髓細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，HA在維持組織形態(tài)中發(fā)揮著重要作用，透明質(zhì)酸具有良好的生物活性、生物相容性、生物降解性并可通過化學(xué)改性結(jié)合生長因子[12]。牙發(fā)育過程中，牙髓組織以不同的方式表達(dá)HA，HA有助于牙本質(zhì)基質(zhì)發(fā)育和牙髓生長，隨著年齡的增長，其表達(dá)逐漸減少[13]，可見HA在保持牙髓活力和誘導(dǎo)牙本質(zhì)修復(fù)中起著重要作用，體內(nèi)實驗研究表明 ，未經(jīng)修飾的HA機械強度較低[14]，HA聯(lián)合其他材料的微球作為支架結(jié)合間充質(zhì)干細(xì)胞可再生牙髓樣組織[15]。HA和己二酸二酰肼反應(yīng)并制備水凝膠應(yīng)用于組織再生，基于髓腔和根管的解剖特點，微球載體更為適宜作為牙髓再生的種子細(xì)胞載體，但HA微球作為牙髓再生支架的研究未見報道。目前制備透明質(zhì)酸微球的方法如噴霧干燥法[16]，需要復(fù)雜的裝置，成本較高，本研究采用的方法簡單，成本低，利用機械攪拌裝置即可達(dá)到制備的要求，條件溫和且容易控制，制備過程中使用ADH和EDC作為反應(yīng)的交聯(lián)劑，避免因使用戊二醛作為交聯(lián)劑帶來的毒性影響，微球最終為粉末狀外觀，較HA凝膠方便儲存，作為支架材料可采用注射的方法到達(dá)相應(yīng)的部位，相比于凝膠易流動，其固位穩(wěn)定性能更佳。本研究利用乳化-溶劑揮發(fā)法和化學(xué)交聯(lián)方法制備具有良好機械性能和細(xì)胞相容性的HA微球。本研究制備的HA微球，SEM觀察微球表面光滑，粒徑大小均勻一致，粒徑分布圖進(jìn)一步驗證其為窄分布，解決了交聯(lián)反應(yīng)不均勻的問題，能夠為組織工程提供優(yōu)良的支架，但此方法制備的微球易粘連聚集的問題有待進(jìn)一步的解決。HA凝膠顆粒具有大小可調(diào)，膠體穩(wěn)定性好，細(xì)胞毒性低，表面積大，抗酶降解等優(yōu)點，亦可作為理想的藥物載體。

近年來，HA生物材料的開發(fā)和應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展，相關(guān)研究取得了長足的進(jìn)展。HA是CD44的主要配體，在細(xì)胞外基質(zhì)/液體中含量豐富，有助于組織的水動力學(xué)和穩(wěn)態(tài)，且HA可通過與細(xì)胞表面受體(包括CD44、LYVE-1和RHAMM)結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移和分化[17]，本研究發(fā)現(xiàn)，DPSC可在HA微球表面粘附和增殖，可見HA微球具有良好的細(xì)胞相容性，關(guān)于其中的粘附機制有待進(jìn)一步研究。組織化學(xué)研究表明，牙齒發(fā)育過程中透明質(zhì)酸合成酶(HAS)的表達(dá)與CD44的表達(dá)相對應(yīng)[18]。HA作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，具有很好的生物相容性，生物可降解性，非免疫原性，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中發(fā)揮著重要的作用[19-20]。但天然HA生物機械性能較低，限制了其在組織工程方面的應(yīng)用，利用乳化-交聯(lián)的方法制備HA微球，可提高材料的機械性能，本研究制備的HA微球不僅為細(xì)胞的生長提供更大的粘附面積，還為細(xì)胞遷移和組織延伸提供支撐。

本研究的關(guān)于DPSC在HA微球表面增殖結(jié)果表明，在相同的時間，DPSCs數(shù)目隨著HA微球濃度的增加而增多，說明HA微球具有良好的細(xì)胞相容性及促進(jìn)DPSC細(xì)胞增殖的作用，因此，HA微球可作為DPSC載體應(yīng)用于牙髓組織再生。另外，HA是牙髓組織中細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，以HA微球最為載體進(jìn)行牙髓再生，可解決部分降解殘余支架材料降解周期過長而占據(jù)一定的根管空間并阻礙再生牙髓組織進(jìn)一步生長的問題[21]。HA微球可進(jìn)一步修飾或結(jié)合生長因子應(yīng)用于其他組織工程，HA微球具有很廣闊的應(yīng)用前景。

組織工程已成為修復(fù)多種組織損傷或缺損的具有應(yīng)用前景的治療方法[22-23]， hDPSCs具有良好的成牙分化潛能，可作為牙組織工程和再生的種子細(xì)胞，其在骨組織工程再生應(yīng)用中也發(fā)揮著重要促成骨作用[24-25]。干細(xì)胞組織工程研究的重點是種子細(xì)胞的增殖、遷移和分化等。充足的種子細(xì)胞和良好生物相容性的支架材料是組織再生的關(guān)鍵要素。本研究制備的HA微球具有良好的細(xì)胞相容性，其可作為高質(zhì)量的種子細(xì)胞支架促進(jìn)hDPSCs的增殖和分化，該HA微球有望在包括牙髓組織再生在內(nèi)的組織工程應(yīng)用和研究方面發(fā)揮重要作用。