許亮 劉姍姍 周小芬 馬勝男 朱小峰

缺氧或低氧是實(shí)體腫瘤重要的微環(huán)境特征之一，在缺氧微環(huán)境下缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)高度表達(dá)，在維持細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)中起重要作用[1]。HIF-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，它是由HIF-1α和HIF-1β組成的異二聚體。HIF-1α蛋白在常氧條件下迅速降解，并在低氧條件下穩(wěn)定，而HIF-1β蛋白組成型表達(dá)。HIF-1α已被認(rèn)為與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，糖酵解，癌細(xì)胞增殖/存活和腫瘤微血管等多種生物代謝途徑存在密切關(guān)聯(lián)[2]。為進(jìn)一步探討HIF-1α對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的相關(guān)作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因沉默技術(shù)，研究HIF-1α基因?qū)谇击[癌細(xì)胞凋亡及周期的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人口腔鱗癌TSCCA細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)；RPMI-1640培養(yǎng)基、青/鏈雙抗、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(HyClone公司，美國(guó))；胎牛血清(Gibco公司，美國(guó))；缺氧誘導(dǎo)劑(CoCl2)、CCK-8試劑盒、Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；Bcl-2、Bax、Caspase-3、PARP、CDK1/2、cyclin A、cyclin B、p21、β-actin單克隆抗體、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗(Santa Cruz公司，美國(guó))；ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Thermo公司，美國(guó))；多功能酶標(biāo)儀(BioTek公司，美國(guó))；AI600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(GE公司，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(Bekman Coulter公司，美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人口腔鱗癌TSCCA細(xì)胞接種于含10%胎牛血清，1%青/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為飽和濕度，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。采用100 μmol/L CoCl2處理細(xì)胞模擬缺氧環(huán)境[3]。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶將細(xì)胞消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 構(gòu)建HIF-1α基因沉默口腔癌細(xì)胞系

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人口腔鱗癌TSCCA細(xì)胞，用胰酶-EDTA混合液消化后制成單細(xì)胞懸液接種于6 孔板中，使每孔細(xì)胞數(shù)量保持在1×104個(gè)放入37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞滿度達(dá)到40%時(shí)加入濃度為5 μg/ml的聚乙烯培養(yǎng)液2 ml，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min，然后從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞，將慢病毒感染也置于冰上緩慢溶解，根據(jù)上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)公司的慢病毒感染說(shuō)明書(shū)(GV115載體)，向六孔板中加入1×107TU/ml濃度的病毒液量進(jìn)行細(xì)胞感染；放入培養(yǎng)箱12 h后，吸去含病毒的培養(yǎng)液，換上新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；之后可通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度，此時(shí)感染成功的細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光表達(dá)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%進(jìn)行細(xì)胞傳代。然后換上含適當(dāng)濃度的嘌呤霉素的新鮮完全培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，最終獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。

將細(xì)胞分為正常對(duì)照組(未處理TSCCA細(xì)胞)；陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)基因序列的TSCCA細(xì)胞)；基因沉默組(轉(zhuǎn)染HIF-1α反義基因序列的TSCCA細(xì)胞)。

1.4 細(xì)胞存活率檢測(cè)

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TSCCA細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度，96孔板里每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，使3 組細(xì)胞數(shù)約為1×104個(gè)/孔。缺氧處理細(xì)胞12, 24, 48 h后，加入10 μl CCK-8，在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度(A450)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A450值-空白調(diào)零組A450值)/(對(duì)照組A450值-空白調(diào)零組A450值)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

把處于對(duì)數(shù)期的TSCCA細(xì)胞以200 μl/孔接種至6 孔板，孵育12～16 h。待細(xì)胞融合度65%～75%時(shí)，3 組細(xì)胞缺氧處理24 h。加入200 μl T/E消化后，收集細(xì)胞懸液至tube管中，使用Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，根據(jù)附帶的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞周期

收集3 組TSCCA細(xì)胞懸液，按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

收集不同處理組的TSCCA細(xì)胞懸液，提取蛋白，SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，封閉(5%脫脂乳)，一抗孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)，內(nèi)參采用β-actin。數(shù)據(jù)用Image J圖像分析軟件進(jìn)行蛋白定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 HIF-1α基因沉默口腔癌細(xì)胞系的構(gòu)建

GV115載體與軟件設(shè)計(jì)的HIF-1α反義序列(表 1)及無(wú)義序列經(jīng)過(guò)酶切連接后，獲得重組的慢病毒載體，然后用其感染TSCCA細(xì)胞。如圖 1，細(xì)胞呈規(guī)則圓形，大小均勻，排列致密整齊，生長(zhǎng)狀態(tài)良好；并且綠色熒光顯示感染率超過(guò)70%。接下來(lái)通過(guò)添加嘌呤霉素進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后，通過(guò)Western blot檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá)情況。如圖 2，缺氧培養(yǎng)24 h后，基因沉默組HIF-1α蛋白含量顯著低于其他兩處理組，而正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P<0.05)，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HIF-1α基因沉默口腔癌細(xì)胞系構(gòu)建成功。

表 1 HIF-α基因沉默序列

2.2 HIF-1α基因沉默對(duì)TSCCA細(xì)胞增殖的影響

通過(guò)CCK-8對(duì)缺氧處理12、24、48 h后TSCCA細(xì)胞的增殖活性進(jìn)行了檢測(cè)。如圖3所示，隨著缺氧處理時(shí)間的增加，3 組細(xì)胞的增殖活性均受到一定程度的抑制；而缺氧處理12 h后，3 組細(xì)胞的增殖抑制率未見(jiàn)顯著性差異；當(dāng)缺氧處理24 h后，基因沉默組的增殖活性受到顯著抑制(P<0.05)；但是缺氧處理時(shí)間達(dá)到48 h，基因沉默組的增殖抑制率超過(guò)60%，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用的缺氧處理時(shí)間為24 h。

圖 1 重組慢病毒轉(zhuǎn)染TSCCA細(xì)胞 (×400) 圖 2 沉默HIF-1α基因?qū)SCCA細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)影響

圖 3 沉默HIF-1α基因?qū)θ毖鮐SCCA細(xì)胞增殖的影響

2.3 HIF-1α基因沉默對(duì)TSCCA細(xì)胞凋亡的影響

為探究HIF-1α基因與細(xì)胞凋亡的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各處理組的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行了檢測(cè)。正常對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為17.14%±2.15%，陰性對(duì)照組為19.67%±1.88%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而基因沉默組顯著上升，高達(dá)53.12%±4.67%，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖 4)。通過(guò)Western blot對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，基因沉默組細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3及PARP表達(dá)量明顯增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著下降(P<0.05)(圖 5)。

2.4 HIF-1α基因沉默對(duì)TSCCA細(xì)胞周期的影響

為探討HIF-1α基因沉默與細(xì)胞周期的相關(guān)性，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各處理組細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)。正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞周期未見(jiàn)明顯異常，而基因沉默組被阻滯在G2/M期；與兩對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.05)(圖 6)。此外，HIF-1α基因沉默組的G2/M期蛋白CDK1/2、Cyclin A、Cyclin B蛋白表達(dá)量減少，而CDK抑制因子p21增加，與正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.05)(圖 7)。

圖 4 沉默HIF-1α基因?qū)SCCA細(xì)胞凋亡的影響

圖 5 沉默HIF-1α基因?qū)SCCA細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

口腔癌是發(fā)病于頰黏膜、上下齦、硬腭、舌和口底的惡性腫瘤，主要以鱗狀細(xì)胞癌為主，全球每年新增患者超過(guò)20 萬(wàn)人，而我國(guó)口腔癌的發(fā)病率及死亡率也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[4]。口腔鱗癌是血液供給充足的實(shí)體惡性腫瘤，由于癌細(xì)胞的過(guò)度增殖、無(wú)序性分化以及腫瘤微血管構(gòu)建的延后性，導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)部處于缺氧狀態(tài)，因此，癌細(xì)胞通過(guò)激活缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等物質(zhì)的生成，促使癌細(xì)胞抵抗缺氧的微環(huán)境，從而維持癌細(xì)胞正常的增殖分化，轉(zhuǎn)移侵襲等生物學(xué)進(jìn)程[5-7]。而HIF則是缺氧癌細(xì)胞中特異性活化的關(guān)鍵分子，目前已報(bào)道HIF-1α與腫瘤的生長(zhǎng)增殖，微血管形成以及轉(zhuǎn)移侵襲密切相關(guān)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，口腔鱗癌細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α被激活，正常對(duì)照組及陰性對(duì)照組的細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯差異，而HIF-1α基因被沉默后，細(xì)胞的增殖活性受到明顯抑制，增殖抑制率顯著高于其他兩處理組；HIF-1α基因表達(dá)在缺氧應(yīng)激條件下維持了癌細(xì)胞的增殖活性。

圖 6 沉默HIF-1α基因?qū)SCCA細(xì)胞周期的影響

圖 7 沉默HIF-1α基因?qū)SCCA細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

另一方面，機(jī)體為了清除產(chǎn)生的癌細(xì)胞則需要通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而控制腫瘤的進(jìn)展，細(xì)胞凋亡在機(jī)體內(nèi)受到一系列相關(guān)途徑的調(diào)控，其中以受體和線粒體各自驅(qū)動(dòng)的凋亡通路為核心[9]。線粒體途徑的激活與否與外膜的通透性密切相關(guān)，當(dāng)其受到某種程度的影響是，促凋亡基因?qū)哪らg隙轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中，進(jìn)而啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)相應(yīng)的凋亡現(xiàn)象，而線粒體外膜的通透程度是由Bcl-2家族內(nèi)部諸多蛋白彼此調(diào)控決定的[10]。本研究發(fā)現(xiàn)：HIF-1α基因沉默后，導(dǎo)致線粒體膜上的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量下降，促凋亡蛋白Bax表達(dá)量上升，從而使二者間的絡(luò)合作用喪失，無(wú)法形成具有選擇性的二聚體，線粒體膜內(nèi)的Cytochrome C外滲進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，促進(jìn)了Caspase-3的剪切，進(jìn)一步破壞了PARP的蛋白活性，引發(fā)了Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)眾多功能蛋白發(fā)生失活，進(jìn)一步破壞了細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，加速了死亡的裂解死亡；因此，HIF-1α的表達(dá)與內(nèi)源性線粒體依賴(lài)性凋亡存在密切聯(lián)系，HIF-1α的激活，進(jìn)一步抑制了口腔鱗癌細(xì)胞的凋亡，使得癌細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境產(chǎn)生抗性，從而維持自身的穩(wěn)態(tài)。

癌癥的不斷增殖與癌細(xì)胞異常的周期進(jìn)程密切相關(guān)，細(xì)胞周期的精密控制對(duì)生物體的分化、發(fā)育、遺傳及生存活動(dòng)均具有很大的影響力，可通過(guò)不同時(shí)相的相互轉(zhuǎn)變使細(xì)胞進(jìn)入增殖、分化或死亡等狀態(tài)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常對(duì)照組及陰性對(duì)照組對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞不具有明顯的周期阻滯作用，而HIF-1α基因沉默后，細(xì)胞周期被阻滯在G2/M期。并且，細(xì)胞周期素(Cyclin)，細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶(Cyclin dependent kinases，CDKs)以及CDK抑制因子(CDK inhibitor，CKI)三者共同調(diào)控著細(xì)胞周期進(jìn)程[12]。其中G2/M期相關(guān)的蛋白有Cyclin A/B和CDK1/2。CDK1與Cyclin B，CDK2與Cyclin A可以形成復(fù)合物，2 種復(fù)合物的產(chǎn)生可以使細(xì)胞越過(guò)G2期檢驗(yàn)點(diǎn)，從而使細(xì)胞進(jìn)入增殖分裂期。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIF-1α基因沉默后，Cyclin A/B和CDK1/2表達(dá)量下降，并且能夠與CDK1/Cyclin B，CDK2/Cyclin A兩種復(fù)合物結(jié)合的CDK抑制因子p21蛋白表達(dá)量升高。因此，HIF-1α基因沉默后，引起細(xì)胞周期阻滯的作用機(jī)制可能是，HIF-1α的基因沉默，導(dǎo)致p21蛋白的抑制作用被解除，使細(xì)胞在進(jìn)入周期檢驗(yàn)點(diǎn)時(shí)，p21與Cyclin B1/ CDK1復(fù)合體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)合體無(wú)法發(fā)生磷酸化激活，使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行有絲分裂，從而達(dá)到抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖的作用。

綜上所述，缺氧條件下，沉默HIF-1α基因能夠抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖，促使癌細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴(lài)性凋亡，并使癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期周期阻滯。HIF-1α與口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、凋亡及周期存在密切相關(guān)性，阻斷HIF-1α的表達(dá)對(duì)于治療口腔鱗癌可能具有重要的意義。