劉翠 徐曉麗 李金儒 朱彪 李歡 向光大 郭紅延

隨著人口老齡化的發(fā)展，2型糖尿病患者人數(shù)迅猛增加[1]。2型糖尿病是一種以高血糖為基礎(chǔ)表征的慢性代謝性疾病，高血糖抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)骨向分化。因此，糖尿病患者的種植成功率遠(yuǎn)低于健康人群[2]。骨骼也是一種內(nèi)分泌器官，骨源性生長(zhǎng)因子參與全身代謝的調(diào)節(jié)[3]。Korf-Klingebiel等[4]利用生物信息學(xué)技術(shù)從骨髓細(xì)胞中篩選出一種新型骨髓源性分泌蛋白，并將其命名為髓源性生長(zhǎng)因子(myeloid-derived growth factor，MYDGF)，其可通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡，而PI3K/Akt信號(hào)通路在糖代謝的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)，MYDGF可通過(guò)提高胰高血糖素樣肽1的分泌改善2型糖尿病小鼠的血糖水平[5]。但是，MYDGF能否促進(jìn)糖尿病小鼠BMSCs成骨分化及其機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬以體外培養(yǎng)的糖尿病小鼠BMSCs為研究對(duì)象，探討MYDGF對(duì)糖尿病小鼠BMSCs骨向分化的影響及其信號(hào)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

4 周齡雄性SPF級(jí)C57小鼠10 只及高脂飼料(60.0%的能量由脂肪供應(yīng))(北京華阜康生物科技有限公司)。重組MYDGF、茜素紅S染色試劑盒(北京百奧萊博)；α-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))；胎牛血清(Gemini，美國(guó))；胰酶、β-甘油磷酸鈉、左旋維生素C、地塞米松、L-谷氨酰胺、DMSO、青霉素、鏈霉素(Sigma，美國(guó))；Trizol(Invitrogen，美國(guó))；CCK-8試劑盒(武漢博士德)；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(上海碧云天生物)；兔抗人磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)單克隆一抗, 磷酸化PI3K(p-PI3K)單克隆一抗、兔抗鼠蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)單克隆一抗，磷酸化Akt(p-Akt)單克隆一抗、山羊抗兔單克隆二抗(Cell Signaling Technology，美國(guó))；CD44、CD45、CD31、CD34、CD73、CD90、CD105、CD29抗體(BD Biosciences，美國(guó))；BCA測(cè)定試劑盒(南京建成)；PVDF膜(Millipore，美國(guó))。

MCO-15AC型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo，日本)；SW-CJ-1FD型生物凈化工作臺(tái)(蘇州安泰)；穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀(強(qiáng)生公司，美國(guó))；5702R型低速離心機(jī)、Biophotometer核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf，德國(guó))；340型酶聯(lián)儀(BDSL，英國(guó))；CytoFLEX 型流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，美國(guó))；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器)；BX-53型正置熒光顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 糖尿病小鼠造模

10 只C57小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)4 周，小鼠禁食12 h后按照50 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，連續(xù)注射5 d。注射1 周后檢測(cè)血糖，以空腹血糖≥7.0 mmol/L和(或)餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L作為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)，共成功造模7 只。

1.3 全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)BMSCs

無(wú)菌條件下分離糖尿病小鼠雙側(cè)脛骨，鈍性剝離肌肉，將脛骨浸入PBS緩沖液中，剪掉干骺端，暴露髓腔。使用1 ml注射器抽取PBS緩沖液反復(fù)沖洗髓腔，將沖出的骨髓液1 000 r/min離心后棄上清；然后，用α-MEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，接入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，4 d后全換液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底面積的90%時(shí)，開(kāi)始傳代。

1.4 BMSCs表型鑒定

0.5 g/L胰酶消化第3代BMSCs制成2×105/ml單細(xì)胞懸液備用。使用200 μl EP管，分別加入熒光標(biāo)記的抗CD44、CD45、CD31、CD34、CD73、CD90、CD105、CD29抗體，4 ℃避光孵育30 min。然后，使用PBS緩沖液洗去未結(jié)合的抗體，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

取第3代BMSCs單細(xì)胞懸液，以2.0×103/孔的密度接種于96 孔板，分別加入0(對(duì)照組；Vehicle)、25、50、100、200 ng/ml MYGDF(每組5 個(gè)復(fù)孔)。接種24 h后檢測(cè)，連續(xù)檢測(cè)6 d。檢測(cè)時(shí)每孔中加入10 μl CCK8溶液，避光孵育培養(yǎng)2 h，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值(A值)。

1.6 ALP活性定量

將BMSCs以5.0×103/孔的密度接種于96 孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)孔底面積的80%時(shí)，換為成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)。同時(shí)加入0(對(duì)照組；Vehicle)、25、50、100、200 ng/ml MYGDF(每組3 個(gè)復(fù)孔)，分別于成骨誘導(dǎo)后的第1、3、5、7天，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)。因MYGDF可呈濃度依賴(lài)性地升高ALP活性，且100 ng/ml與200 ng/ml 濃度對(duì)升高ALP活性的作用無(wú)差異，故以下實(shí)驗(yàn)采用100 ng/ml MYGDF作為干預(yù)濃度。

1.7 qPCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因

加或不加100 ng/ml MYGDF的BMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d后提取總RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件參照既往報(bào)道[6]。檢測(cè)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor 2，Runx2)、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(Osterix，Osx)、ALP和骨鈣素(osteocalcin，OCN)等基因，基因引物(表 1)由上海申工生物合成。

表 1 qPCR引物序列

1.8 PI3K/Akt信號(hào)通路的檢測(cè)

取BMSCs單細(xì)胞懸液，以6.0×106/孔的密度接種于24 孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)板底面積約75%時(shí)，換為成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為3 組(每組5 個(gè)復(fù)孔)進(jìn)行藥物干預(yù)：Vehicle組，MYGDF組和MYGDF+LY294002(PI3K特異性抑制劑)組。加藥順序：先加LY294002(50 μmol/L)預(yù)處理30 min，然后加入MYGDF。加藥完成后繼續(xù)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，提取總蛋白，每個(gè)樣本取50 μg總蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加抗體，顯影，最后使用Image J軟件分析膠片灰度；加藥后繼續(xù)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d行茜素紅染色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。實(shí)驗(yàn)步驟至少重復(fù)3 次。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的形態(tài)及表面標(biāo)志物

分離的BMSCs體外培養(yǎng)3 d后即有細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈集落樣，形態(tài)不規(guī)則。1 周后，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)目增多。約9 d后，細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底面積的90%，開(kāi)始傳代培養(yǎng)。傳代后細(xì)胞呈長(zhǎng)條狀或者紡錘狀(圖 1)，生長(zhǎng)迅速，4～5 d便鋪滿(mǎn)瓶底面積的90%。干性鑒定結(jié)果顯示(圖 2)：BMSCs不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD31(0.20%)，CD34(0.41%)，CD45(0.65%)；高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD44(99.99%)，CD73(99.76%)，CD105(93.50%)，CD29(99.73%)和CD90(98.40%)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明成功分離培養(yǎng)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞。

圖 1 BMSCs形態(tài)

圖 2 BMSCs表面標(biāo)志物

2.2 BMSCs的增殖

BMSCs增殖曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果顯示：與Vehicle組相比，不同濃度的MYGDF均能顯著促進(jìn)糖尿病小鼠BMSCs增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但是，25、50、100與200 ng/ml MYGDF促進(jìn)BMSCs增殖的作用組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表 2)。

2.3 ALP活性定量

誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d后，BMSCs的ALP活性開(kāi)始上升。在第5天時(shí)，OD值達(dá)到高峰，之后開(kāi)始下降。在25～200 ng/ml的濃度范圍內(nèi)，MYGDF呈濃度依賴(lài)性地升高BMSCs的ALP活性，而100 ng/ml與200 ng/ml MYGDF提高BMSCs ALP活性的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 3)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用100 ng/ml MYGDF作為干預(yù)濃度。

表 2 BMSCs增殖A值

2.4 成骨基因的表達(dá)

PCR結(jié)果表明：與Vehicle組相比較，MYDGF顯著促進(jìn)成骨相關(guān)基因Runx2、Osx和ALP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖 4)。

圖 3 各組細(xì)胞ALP活性

圖 4 各組細(xì)胞成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

2.5 PI3K/Akt信號(hào)通路在MYDGF促進(jìn)BMSCs骨向分化中的作用

Western blot結(jié)果(圖 5)顯示，與Vehicle組相比，MYDGF顯著提高PI3K和Akt的磷酸化水平(P<0.05)，而MYDGF升高p-PI3K和p-Akt表達(dá)的作用在加入LY294002后部分消失，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在BMSCs成骨分化的過(guò)程中，MYDGF能激活PI3K/Akt信號(hào)通路。接下來(lái)，進(jìn)一步采用茜素紅染色探究PI3K/Akt信號(hào)通路在MYDGF促進(jìn)BMSCs骨向分化中的作用。結(jié)果顯示(圖 5)：Vehicle組相比，與MYDGF組可產(chǎn)生較大的礦化結(jié)節(jié)。而PI3K抑制劑LY294002可減弱MYDGF的作用，形成的礦化結(jié)節(jié)較小。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PI3K/Akt信號(hào)通路至少部分介導(dǎo)了MYDGF促進(jìn)糖尿病小鼠BMSCs成骨分化的作用。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用糖尿病小鼠BMSCs為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)MYDGF既可促進(jìn)糖尿病小鼠BMSCs增殖，又能促進(jìn)其骨向分化，并且MYDGF促進(jìn)糖尿病小鼠BMSCs成骨分化的作用與激活PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān)。

圖 5 PI3K/Akt信號(hào)通路在MYDGF促進(jìn)BMSCs骨向分化中的作用

骨骼是運(yùn)動(dòng)器官，也是機(jī)體礦物質(zhì)的儲(chǔ)存庫(kù)，還參與造血。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，骨骼也是一種內(nèi)分泌器官，骨骼來(lái)源的細(xì)胞因子能調(diào)節(jié)并維持機(jī)體糖代謝的平衡。例如：成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分泌的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23是胰島素抵抗發(fā)生的標(biāo)志物[7]；成骨細(xì)胞分泌的骨鈣素可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖并促進(jìn)胰島素分泌[8]，而且骨鈣素還能促進(jìn)葡萄糖的利用[9]；BMSCs外泌體來(lái)源的MiR-29b-3p能改善衰老相關(guān)的胰島素抵抗[10]。MYDGF是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種骨髓來(lái)源的細(xì)胞因子，由單核巨噬細(xì)胞分泌[11]。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MYDGF能改善2型糖尿病小鼠的血糖水平[5]。本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，MYDGF可對(duì)抗高糖對(duì)BMSCs成骨分化的抑制作用，促進(jìn)糖尿病小鼠BMSCs成骨分化。

最近有研究表明，MYDGF發(fā)揮心肌梗死的保護(hù)作用與激活PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)[4]， PI3K/Akt信號(hào)通路也是胰島素發(fā)揮作用的主要信號(hào)通路。而且，在BMSCs成骨分化的過(guò)程中，PI3K/Akt信號(hào)通路也發(fā)揮重要作用。例如，利拉魯肽可通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)犬BMSCs成骨分化[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)探討PI3K/Akt信號(hào)通路在MYDGF促進(jìn)糖尿病小鼠BMSCs成骨分化中的作用。結(jié)果表明，MYDGF可激活PI3K/Akt信號(hào)通路；并且在特異性地阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后，MYDGF促進(jìn)糖尿病小鼠BMSCs成骨分化的作用部分消失。但是， 阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后，MYDGF的作用并未完全消失，這提示MYDGF也可能通過(guò)其它信號(hào)通路進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 眾所周知，Wnt/β-catenin是BMSCs成骨分化的經(jīng)典信號(hào)通路，而MYDGF促進(jìn)糖尿病小鼠BMSCs成骨分化的過(guò)程中是否也能激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路值得進(jìn)一步研究。

Runx2和Osx是成骨細(xì)胞特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[12]。本實(shí)驗(yàn)qPCR結(jié)果表明，在成骨分化過(guò)程中，MYDGF促進(jìn)糖尿病小鼠BMSCs細(xì)胞Runx2和Osx轉(zhuǎn)錄表達(dá)。啟動(dòng)Runx2和Osx的轉(zhuǎn)錄表達(dá)后可促進(jìn)下游骨蛋白的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)骨形成[13]，ALP和OCN分別是成骨早期和進(jìn)入礦化期的標(biāo)志物[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，MYDGF顯著升高ALP的轉(zhuǎn)錄水平，而升高OCN轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用并不明顯。這可能是由于PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的時(shí)間是在成骨早期，所以晚期成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)并不顯著。

本研究還存在一些局限性。例如，本研究只關(guān)注了MYDGF對(duì)糖尿病小鼠BMSCs成骨分化的影響及其信號(hào)機(jī)制，而進(jìn)一步探討MYDGF對(duì)正常小鼠BMSCs成骨分化的影響將會(huì)加深對(duì)MYDGF作用的了解并擴(kuò)大MYDGF的應(yīng)用范疇。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MYDGF能夠促進(jìn)糖尿病小鼠BMSCs成骨分化，因此MYDGF干預(yù)可能是未來(lái)改善糖尿病患者種植區(qū)骨量不足的一種潛在的治療方法。