楊亦文，陳穎熙，蔡影峰，邢斯程，吳芮庭，陳凝雪，廖新俤，2，3*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州510642；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642）

豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)是抗生素抗性基因的重要儲(chǔ)存庫(kù)，其最高絕對(duì)豐度達(dá)到108copies·mL-1，相對(duì)豐度達(dá)到10-1copies·16S rRNA-1[1-2]。豬場(chǎng)廢水中的抗性基因由不同耐藥類型的抗性基因亞類組成。Jia等[3]在豬場(chǎng)廢水中檢測(cè)到196 種抗性基因，包括常見(jiàn)四環(huán)素類、氨基糖苷類、磺胺類、多重耐藥類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、甲氧芐啶、鏈霉素、多黏菌素和萬(wàn)古霉素等的14 大類抗性基因。廢水中不同類型的抗性基因存在于菌群中，賦予菌群抵御不同類型抗生素的能力，甚至存在于作物病原菌和人類致病菌中，增加耐藥性的污染風(fēng)險(xiǎn)。然而，研究表明豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)并不能完全去除廢水中的抗性基因，其系統(tǒng)出水中仍能檢測(cè)到102～106copies·mL-1的抗性基因[2，4]。系統(tǒng)出水中殘留的抗性基因及耐藥菌會(huì)隨著出水被重復(fù)利用或外排進(jìn)入到環(huán)境中，對(duì)豬場(chǎng)及周邊環(huán)境造成更廣泛的污染，威脅養(yǎng)殖生產(chǎn)及公共健康。

廢水中的總抗性基因包括細(xì)菌胞內(nèi)抗性基因和胞外抗性基因[5-6]。目前大部分的研究側(cè)重細(xì)菌胞內(nèi)抗性基因，缺少對(duì)胞外抗性基因的研究。胞外抗性基因包括廢水中游離的抗性基因及噬菌體所攜帶的抗性基因。水體中游離的抗性基因是指游離的核酸片段，存在形態(tài)不穩(wěn)定，容易受pH、溫度和重金屬等環(huán)境因子的影響[7]，并且只有融入到細(xì)菌中才能發(fā)揮其耐藥功能。噬菌體是細(xì)菌之間基因水平轉(zhuǎn)移的主要載體，可從感染細(xì)菌中攝取抗性基因，是廢水中抗性基因的小型儲(chǔ)存庫(kù)[8-9]。在噬菌體感染下一個(gè)細(xì)菌時(shí)，其攜帶的抗性基因可通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式傳播到其他細(xì)菌中，實(shí)現(xiàn)抗性基因在不同細(xì)菌間的水平轉(zhuǎn)移，增加環(huán)境抗性基因污染的復(fù)雜性。因此，環(huán)境中噬菌體攜帶抗性基因的污染現(xiàn)狀受到廣泛關(guān)注，在畜禽糞便、農(nóng)田土壤和城市污水等環(huán)境均檢測(cè)到高豐度的噬菌體攜帶抗性基因。豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水是周邊環(huán)境重要的潛在污染源之一。然而，目前鮮有關(guān)于豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水及周邊環(huán)境中噬菌體攜帶抗性基因的報(bào)道。

基于此，本研究選擇5 個(gè)典型豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)為研究對(duì)象，采集其出水樣及排入河流上下游水樣，檢測(cè)9 種抗性基因及2 種整合子基因的豐度，分析其在不同豬場(chǎng)出水及周邊河流中的污染特征，初步探討豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水中噬菌體攜帶抗性基因?qū)χ苓吅恿鳝h(huán)境的影響，為評(píng)估養(yǎng)豬場(chǎng)抗性基因污染風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣豬場(chǎng)

選擇位于江西省境內(nèi)的5 個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)的廢水處理系統(tǒng)，采集其系統(tǒng)出水及排入河流上、下游水樣。共采集5 個(gè)種豬場(chǎng)，編號(hào)分別為A、B、C、D、E，其養(yǎng)殖規(guī)模分別為5 500、3 500、6 000、9 000、16 000頭（存欄母豬），均采用厭養(yǎng)+兩級(jí)A/O（缺氧、好氧工藝）+加藥混凝、消毒廢水處理系統(tǒng)。

1.2 主要儀器及試劑

主要儀器：普通PCR 儀（BIO-RAD，T100，美國(guó)）、凝膠成像系統(tǒng)（Tanon，2500，中國(guó)）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（BIO-RAD，CFX96，美國(guó)）、循環(huán)水真空泵[瑞德，SHZ-D（Ⅲ），中國(guó)]、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Micro 17R，Thermo Scientific，美國(guó)）、微量紫外分光光度計(jì)（Nano Drop，2000，Thermo Scientific，美國(guó)）和-80 ℃超低溫冰箱（Haier，DW-86L626，中國(guó)）。

主要試劑：SYBR Green 熒光定量檢測(cè)試劑盒（TIANGEN，F(xiàn)P209，中國(guó)）、pMD18-T Vector（Takara，日本）、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（TIANGEN，CB101，中國(guó)）、噬菌體DNA 提取試劑盒（TIANGEN，TIANamp Virus DNA/RNA Kit，中國(guó)）、質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA，Plasmid Mini Kit，美國(guó)）、超強(qiáng)高保真PCR 試劑盒（TIANGEN，KP203，中國(guó)）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水樣采集及預(yù)處理

采集5 個(gè)典型豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)的出水樣、排入河流的上游200 m 處水樣和下游200 m 處水樣，每一個(gè)采樣點(diǎn)同時(shí)采集3 個(gè)樣品作為3 個(gè)重復(fù)；每個(gè)重復(fù)樣采集相隔1 m，采集水面10 cm 處水樣，每個(gè)樣4 L。所有樣品用冰覆蓋運(yùn)輸，當(dāng)日到達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行預(yù)處理。用0.22 μm 孔徑低蛋白結(jié)合濾膜去除水樣中的細(xì)菌，獲得含有噬菌體的濾液，并用100 kDaAmicon Ultra 離心過(guò)濾器（Millipore）濾去游離的核酸，并將濾液濃縮至1 mL（濃縮500倍）。含噬菌體的濃縮樣于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

提取樣品噬菌體中的DNA，檢測(cè)3種四環(huán)素類抗性基因（tetG、tetX和tetW）、2種磺胺類抗性基因（sul1和sul2）、2種大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因（ermA和ermB）、1種β-內(nèi)酰胺類抗性基因（blaTEM）、1 種氯霉素類抗性基因（cmlA）和2個(gè)整合子基因（intl1和intl2）的絕對(duì)豐度。

（1）噬菌體DNA提?。喊凑帐删wDNA提取試劑盒（TIANGEN，TIANamp Virus DNA/RNA Kit，中國(guó)）提供的說(shuō)明書(shū)提取樣品中的噬菌體DNA，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定所提取DNA 樣品的濃度及D260/280，經(jīng)1%凝膠電泳分析所提DNA 樣品的質(zhì)量，并用16S rRNA 通用引物對(duì)所提DNA 樣品進(jìn)行定性，確保所提噬菌體DNA樣品不含細(xì)菌DNA。

（2）建立熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線：參考本團(tuán)隊(duì)之前研究構(gòu)建的qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。主要步驟如下：利用抗性基因特異性引物（表1）對(duì)樣品進(jìn)行普通PCR，通過(guò)凝膠電泳獲得特異性條帶。將確認(rèn)后的特異性條帶進(jìn)行回收純化，構(gòu)建于pMD180T 載體中，并轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。菌液擴(kuò)繁，提取菌液質(zhì)粒進(jìn)行10 倍稀釋，獲得以質(zhì)粒為模板的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的拷貝數(shù)（copies）=L×C/（N×M×109），其中L為阿弗加德羅常數(shù)（6.02×1023），C是質(zhì)粒DNA濃度，N為目的DNA 模板長(zhǎng)度（目的基因長(zhǎng)度+2 992 bp），M為每對(duì)DNA的平均分子量（660）。

每個(gè)稀釋梯度設(shè)3 個(gè)重復(fù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為25 μL：SYBR Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.75 μL，ddH2O 10 mL，模板1 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，40 個(gè)循環(huán)，溶解曲線按默認(rèn)程序。所有基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率在95%～105%，R2大于0.99。

表1 抗性基因及整合子PCR引物信息Table 1 PCR primer information of resistance genes and integrants

（3）樣品中抗性基因及可移動(dòng)遺傳元件的檢測(cè)：采用建立好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品噬菌體DNA 為模板，使用（2）的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)，檢測(cè)樣品噬菌體中抗性基因及可移動(dòng)遺傳元件的拷貝數(shù)?？剐曰蚝涂梢苿?dòng)遺傳元件拷貝數(shù)（copies·mL-1）=標(biāo)曲算出的拷貝數(shù)（copies·μL-1）×DNA 洗脫體積（μL）/樣品體積（mL），基因絕對(duì)豐度使用基因拷貝數(shù)（N）的以10為底的對(duì)數(shù)（lgN）表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

檢測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 進(jìn)行初步處理，GraphPad Prism 8.0 軟件作圖，SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析（Spearman），結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體攜帶抗性基因的檢出情況

對(duì)5 個(gè)典型豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水及周邊河流上下游水樣中的9種噬菌體攜帶抗性基因和2種整合子基因進(jìn)行普通PCR 定性檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。所有樣品均檢測(cè)到抗性基因blaTEM、sul2、tetW和tetX；在豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水中只有1/5（C 場(chǎng)）的采樣點(diǎn)檢測(cè)到抗性基因cmlA，2/5（B場(chǎng)和C場(chǎng)）的采樣點(diǎn)檢測(cè)到抗性基因sul1，而所有上下游樣品均檢測(cè)到cmlA和sul1；在系統(tǒng)出水中只有1/5（E 場(chǎng)）的采樣點(diǎn)檢測(cè)到抗性基因ermA，而有4/5 的上游河流采樣點(diǎn)和3/5 的下游河流采樣點(diǎn)檢測(cè)到ermA，表明豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水中噬菌體攜帶抗性基因檢測(cè)率低于周邊的河流樣，這也說(shuō)明本研究中的豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水不是周邊河流噬菌體攜帶抗性基因的主要污染來(lái)源。所有上游河流樣都檢測(cè)到抗性基因ermB和tetG，而在下游河流中只有4/5（除了B 場(chǎng)）的采樣點(diǎn)檢測(cè)到ermB和tetG；上游河流樣中有4/5 的采樣點(diǎn)檢測(cè)到抗性基因ermA，而下游只有3/5 的采樣點(diǎn)檢測(cè)到ermA，表明下游河流樣中的噬菌體攜帶抗性基因檢出率低于上游河流樣，也說(shuō)明河流中的抗性基因等污染物可能通過(guò)河流自凈功能被消除[19]。此外，所有樣品噬菌體中都檢測(cè)到與基因水平轉(zhuǎn)移相關(guān)的整合子基因intl1和intl2，這增加了系統(tǒng)出水和周邊河流中噬菌體攜帶抗性基因污染的復(fù)雜性。

表2 不同采樣點(diǎn)中抗性基因及整合子基因的檢出情況Table 2 Detection of resistance genes and integron genes in different sampling sites

表3 樣品中抗性基因及整合基因絕對(duì)豐度Table 3 The logarithm of the copy number of resistance genes and integron genes in samples

2.2 噬菌體攜帶抗性基因的含量及其相關(guān)性

對(duì)所有樣品中的噬菌體攜帶抗性基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 個(gè)豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水和周邊河流中含有較高豐度的噬菌體攜帶抗性基因（表3），其中磺胺類抗性基因sul2的平均豐度最高，高達(dá)4.09±0.16，顯著高于四環(huán)素類抗性基因tetX（3.24±0.19）和tetG（3.22±0.29）（P＜0.05）；tetX和tetG的絕對(duì)豐度顯著高于磺胺類抗性基因sul1（2.46±0.39）和四環(huán)素類抗性基因tetW（2.38±0.18）（P＜0.05）；sul1和tetW的絕對(duì)豐度與blaTEM（2.18±0.22）的豐度之間沒(méi)有顯著差異，顯著高于大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermB（2.04±0.18）和氯霉素類抗性基因cmlA（1.93±0.34）（P＜0.05）；大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermA的平均絕對(duì)豐度最低，為1.05±0.28，顯著低于其他抗性基因（P＜0.05）。整合子基因intl1和intl2也被檢測(cè)含有較高的豐度，其平均豐度對(duì)數(shù)值分別為3.70±0.15和2.28±0.18。

對(duì)樣品中9種噬菌體攜帶抗性基因和2種整合子基因的豐度進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，采用Spearman相關(guān)系數(shù)，雙尾檢驗(yàn)，結(jié)果如圖1 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除基因tetW和blaTEM、intl2和ermB，以及intl2和tetW之間外，其余抗性基因之間均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），其中氯霉素抗性基因cmlA分別與β-內(nèi)酰胺類抗性基因blaTEM和磺胺類抗性基因sul1之間存在強(qiáng)正相關(guān)（P＜0.05）；整合子基因intl1分別與抗性基因blaTEM、cmlA和sul1之間呈強(qiáng)正相關(guān)（P＜0.05）。以上結(jié)果表明豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水及周邊河流中的噬菌體攜帶抗性基因及整合子基因之間存在共現(xiàn)模式。

2.3 不同豬場(chǎng)樣品中噬菌體攜帶抗性基因的絕對(duì)豐度

對(duì)不同豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水樣和上下河流水樣中的噬菌體攜帶抗性基因豐度進(jìn)行分析（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同豬場(chǎng)樣品中噬菌體攜帶抗性基因的豐度有較大差異。氯霉素抗性基因cmlA和磺胺類抗性基因sul1的豐度在各豬場(chǎng)之間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）；而β-內(nèi)酰胺類抗性基因blaTEM在豬場(chǎng)E 的絕對(duì)豐度最高，為2.69±0.29，顯著高于其他豬場(chǎng)（P＜0.05）；磺胺類抗性基因sul2在豬場(chǎng)B（4.58±0.21）和C（4.50±0.16）中的豐度顯著高于其他豬場(chǎng)（P＜0.05）；大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermB在豬場(chǎng)C（2.62±0.16）中的豐度顯著高于其他豬場(chǎng)（P＜0.05）；大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermA在豬場(chǎng)E中的豐度最高，為1.43±0.4；四環(huán)素類抗性基因tetG在豬場(chǎng)A 中的豐度最高，為3.62±0.34；tetW在豬場(chǎng)B（2.88±0.35）中的豐度最高；tetX在豬場(chǎng)E 中的豐度最高，為3.68±0.25。

2.4 豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水和河流上下游水樣中噬菌體攜帶抗性基因的絕對(duì)豐度

對(duì)豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水、河流上游和下游水樣中噬菌體攜帶抗性基因的豐度進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)出水中9 種抗性基因的總豐度（2.01±0.21）顯著低于河流上游（3.03±0.13）和下游（2.88±0.16）中總抗性基因的豐度（P＜0.05）（圖3），河流上游的總抗性基因豐度高于河流下游，但差異不顯著（P＞0.05）。其中，β-內(nèi)酰胺類抗性基因blaTEM、氯霉素類抗性基因cmlA、磺胺類抗性基因sul1和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermA在系統(tǒng)出水中的絕對(duì)豐度分別為1.38±0.34、0.10±0.10、0.50±0.31 和0.26±0.26，顯著低于其在河流上下游中的豐度（P＜0.05）（圖4）；抗性基因sul2在河流上游中的豐度高于系統(tǒng)出水和河流下游中的豐度，但差異不顯著（P＞0.05）；其他噬菌體攜帶抗性基因在系統(tǒng)出水、河流上游和下游中的豐度沒(méi)有顯著差異。此外，整合子基因intl1和intl2基因在系統(tǒng)出水中的豐度顯著低于河流上游和下游中的豐度（P＜0.05）。綜上結(jié)果表明，豬場(chǎng)廢水系統(tǒng)出水中抗性基因的豐度顯著低于河流中抗性基因的豐度，這也進(jìn)一步說(shuō)明豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水中噬菌體攜帶的抗性基因未對(duì)周邊河流造成顯著影響。

圖1 不同基因豐度之間相關(guān)性分析熱圖Figure 1 Heatmap of correlation analysis between different gene abundances

3 討論

豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)是連接廢水和外界環(huán)境的重要橋梁，其出水中殘留的抗性基因直接影響周邊環(huán)境的安全。然而目前大部分的報(bào)道僅對(duì)系統(tǒng)出水中的細(xì)菌抗性基因進(jìn)行了研究，缺少關(guān)于系統(tǒng)出水中噬菌體攜帶抗性基因的報(bào)道。研究表明，豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水中仍能檢測(cè)到高豐度的細(xì)菌抗性基因，其檢出豐度高達(dá)105～106copies·mL-1[20-21]。本研究對(duì)5 個(gè)典型豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水中的9 種噬菌體攜帶抗性基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)出水中噬菌體攜帶抗性基因的平均豐度高達(dá)2.01±0.21，其中sul2和tetX平均豐度分別高達(dá)3.85±0.38 和3.24±0.28，說(shuō)明豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)不能完全去除廢水中的噬菌體攜帶抗性基因。此外，還檢測(cè)到高豐度的整合子基因intl1和intl2。整合子基因與細(xì)菌基因水平轉(zhuǎn)移相關(guān)，可把抗性基因等遺傳物質(zhì)整合到轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒等可移動(dòng)遺傳因子上，實(shí)現(xiàn)抗性基因在不同細(xì)菌間的傳播[22]，進(jìn)一步促進(jìn)系統(tǒng)出水中抗性基因的水平轉(zhuǎn)移。系統(tǒng)出水中殘留的噬菌體攜帶抗性基因和整合子基因增加了抗性基因防控的復(fù)雜性，也說(shuō)明在關(guān)注細(xì)菌抗性基因污染的同時(shí)，也應(yīng)重視環(huán)境中噬菌體攜帶抗性基因污染問(wèn)題。

圖2 不同豬場(chǎng)樣品噬菌體攜帶抗性基因的絕對(duì)豐度Figure 2 Absolute abundance of phage carrying resistance genes in samples from different farms

圖3 系統(tǒng)出水及河流上下游水樣中總抗性基因及整合子基因的豐度Figure 3 Abundance of total resistance genes and integron genes in the effluent of the system and the water samples of the upstream and downstream

圖4 系統(tǒng)出水及河流上下游樣品中不同噬菌體攜帶抗性基因的豐度Figure 4 Abundance of resistance genes carried by different bacteriophages in samples from the effluent，upstream and downstream

豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水中殘留的抗性基因會(huì)隨著出水外排進(jìn)入周邊河流中，對(duì)周邊環(huán)境安全造成威脅。本研究在5 個(gè)豬場(chǎng)周邊河流的上下游樣品中均檢測(cè)到9 種噬菌體攜帶抗性基因，其中blaTEM、cmlA、sul1、sul2、tetW和tetX的檢出率是100%。在河流上游中噬菌體攜帶抗性基因的平均檢出豐度高于下游的檢測(cè)豐度，但差異不顯著（P＞0.05）。這說(shuō)明河流本身有一定的自凈功能[19]，能一定程度上降低水體中殘留的噬菌體攜帶抗性基因。意外的是，研究發(fā)現(xiàn)豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水中噬菌體攜帶抗性基因的平均豐度遠(yuǎn)低于河流上下游的平均豐度（P＜0.05），達(dá)到1 個(gè)數(shù)量級(jí)的差異，表明豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水不是周邊河流噬菌體攜帶抗性基因的主要污染源。前期研究也表明，豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水中殘留的細(xì)菌抗性基因豐度顯著低于周邊河流中的豐度（P＜0.05），未對(duì)周邊河流造成顯著影響[10]。目前，我國(guó)典型的豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)末端都有深度處理工藝，系統(tǒng)出水在外排到外界環(huán)境之前會(huì)經(jīng)過(guò)化學(xué)物理等深度處理，雖然不能完全去除出水中殘留的抗性基因，但能殺死大部分的細(xì)菌及噬菌體等微生物，從而能有效減低出水中細(xì)菌及噬菌體攜帶抗性基因的豐度，降低了其對(duì)周邊環(huán)境安全的污染風(fēng)險(xiǎn)[23-24]。但是個(gè)別噬菌體攜帶抗性基因，如ermB和tetW，在廢水處理系統(tǒng)出水中的豐度高于周邊河流中的豐度，對(duì)周邊環(huán)境的安全仍存在較大的威脅，需要加以重視。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)及周邊河流中噬菌體攜帶抗性基因的分布特征具有顯著差異，如豬場(chǎng)E廢水處理系統(tǒng)的出水及周邊河流中噬菌體攜帶抗性基因blaTEM的豐度顯著高于其他處理系統(tǒng)（P＜0.05），豬場(chǎng)C的出水及周邊河流中ermB的豐度顯著高于其他系統(tǒng)（P＜0.05），而豬場(chǎng)D 的出水及周邊河流中sul2的豐度顯著低于其他系統(tǒng)（P＜0.05）。影響抗性基因分布的因子很多，如抗生素、重金屬和消毒水等污染物[1，25]。不同豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)及周邊河流中環(huán)境因子的不同導(dǎo)致其抗性基因分布的差異。在此需要特別注意的是，規(guī)模化豬場(chǎng)和中小型豬場(chǎng)所使用的廢水處理設(shè)施與管理水平有一定的差異，可能會(huì)造成其出水的水質(zhì)及抗性基因殘留水平差異。本研究?jī)H評(píng)估了規(guī)?；i場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水對(duì)周邊河流的影響，中小型豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水中殘留的噬菌體攜帶抗性基因及對(duì)周邊環(huán)境的污染風(fēng)險(xiǎn)需要進(jìn)一步評(píng)估。以上結(jié)果說(shuō)明，噬菌體攜帶抗性基因在不同處理系統(tǒng)及環(huán)境之間的污染差異增加了耐藥性防控的復(fù)雜性，需要針對(duì)不同抗性基因污染的環(huán)境設(shè)計(jì)不同的防控方案。

4 結(jié)論

（1）典型豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水中常見(jiàn)噬菌體攜帶抗性基因污染普遍存在，表明豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)未能完全去除廢水中殘留的噬菌體攜帶抗性基因，進(jìn)一步凸顯了豬場(chǎng)及周邊環(huán)境中抗性基因污染問(wèn)題的嚴(yán)重性。

（2）豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)周邊河流中噬菌體攜帶抗性基因的檢測(cè)率及豐度顯著高于其廢水處理系統(tǒng)出水中的檢出率及豐度（P＜0.05），表明典型豬場(chǎng)廢水處理系統(tǒng)出水中殘留的噬菌體攜帶抗性基因未對(duì)周邊河流造成顯著影響。